本文選題：βB2晶狀體蛋白 + 先天性白內(nèi)障��； 參考：《浙江大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：βB2晶狀體蛋白是人眼晶狀體中重要的結(jié)構(gòu)蛋白,與維持晶狀體的透明性與屈光性密切相關(guān),其潛在的生理功能尚不明確。目前國內(nèi)外針對βB2晶狀體蛋白基因突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的報(bào)道已有不少,但是針對突變具體的致病機(jī)制研究仍很缺乏。為了更好地闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理,從現(xiàn)有的與βB2晶狀體蛋白相關(guān)的基因突變中,選取數(shù)個有意義的關(guān)鍵位點(diǎn)(位于蛋白N末端的突變A2V,以及四個與色氨酸相關(guān)的突變S31W、R145W、W59C、W151C),研究這些突變對pB2晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)分布等方面的影響。 通過PCR從人眼cDNA文庫中克隆βB2晶狀體蛋白的完整編碼序列,構(gòu)建野生型pB2晶狀體蛋白和包含各突變位點(diǎn)的質(zhì)粒,原核表達(dá)質(zhì)粒采用pET28a,真核表達(dá)質(zhì)粒采用pEGFP-C3和pcDNA3.1-flag;原核表達(dá)獲取目標(biāo)蛋白并純化,采用生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究手段,明確突變前后蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面的改變；并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,使野生型和突變型蛋白分別在細(xì)胞中過表達(dá),觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位以及對細(xì)胞凋亡的影響。 我們發(fā)現(xiàn),A2V突變沒有改變pB2晶狀體蛋白的二、三級結(jié)構(gòu),卻影響了蛋白的四級構(gòu)象,破壞了蛋白同源四聚體的形成；降低了蛋白的熱穩(wěn)定性,使蛋白在高溫下更容易聚集；不影響對抗化學(xué)變性劑和紫外輻射的穩(wěn)定性,卻使蛋白在復(fù)性過程更易發(fā)生聚集。W59C和W151C突變使βB2的疏水暴露增加,直接導(dǎo)致突變后蛋白的溶解度顯著降低；S31W和R145W這兩個突變則導(dǎo)致了蛋白熱穩(wěn)定性的明顯下降；另外我們證實(shí)了色氨酸相關(guān)的突變影響了βB2晶狀體蛋白對于紫外輻照的穩(wěn)定性,除R145W外,其余三個突變體的穩(wěn)定性較野生型下降,R145W卻比野生型更能抵抗紫外能量的損傷；將四個突變體在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)后,W59C和W151C在胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的聚集現(xiàn)象,這可能與它們的的溶解度有關(guān),與蛋白水平的結(jié)果一致,說明溶解度下降很可能是這兩個突變在出生即表現(xiàn)為白內(nèi)障的原因。 以上結(jié)果表明,βB2晶狀體蛋白的N末端的突變會對自身的寡聚化造成影響,位于疏水核心的色氨酸殘基突變會顯著影響溶解度和穩(wěn)定性,而結(jié)構(gòu)域表面親水的氨基酸突變?yōu)樯彼岷髣t會降低蛋白穩(wěn)定性,促進(jìn)蛋白聚集。據(jù)此認(rèn)為,βB2晶狀體蛋白基因突變導(dǎo)致的先天性白內(nèi)障,其發(fā)病機(jī)制是多樣的。
[Abstract]:尾 B2 crystallin is an important structural protein in human lens, which is closely related to the transparency and refraction of the lens, and its potential physiological function is not clear. There have been many reports at home and abroad about the mutation of 尾 B2 crystallin gene leading to congenital cataract, but there is still a lack of research on the specific pathogenetic mechanism of the mutation. In order to better elucidate the mechanism of cataract, from the existing gene mutations related to 尾 B2 crystallin, Several significant key sites (A _ 2V at the N-terminal protein and four tryptophan related mutations S31WN R145WN W59C W151C) were selected to study the effects of these mutations on the structure, stability and intracellular distribution of pB2 crystallin. The complete coding sequence of 尾 B2 crystallin was cloned from the human eye cDNA library by PCR, and the wild type pB2 crystallin and plasmids containing various mutation sites were constructed. The prokaryotic expression plasmid was pET28a, the eukaryotic expression plasmid was pEGFP-C3 and pcDNA3.1-flag. the target protein was obtained and purified by prokaryotic expression, and the changes of protein structure and physicochemical properties before and after mutation were determined by biochemical and biophysical methods. The wild-type and mutant proteins were overexpressed in HeLa cells respectively. The localization of proteins in the cells and the effect on apoptosis were observed. We found that the mutation of A2V did not change the secondary and tertiary structure of pB2 crystallin, but affected the conformation of the protein, destroyed the formation of homologous tetramer, reduced the thermal stability of the protein, and made the protein gather more easily at high temperature. The stability of anti-chemical denaturant and ultraviolet radiation was not affected, but the aggregation of protein. W59C and W151C mutation increased the hydrophobic exposure of 尾 B2 during renaturation, which directly reduced the solubility of protein. Two mutations, S31W and R145W, resulted in a significant decrease in the thermal stability of the protein. In addition, we confirmed that tryptophan related mutations affected the stability of 尾 B2 crystallin to UV irradiation, except for R145W. The stability of the other three mutants was more stable than that of wild type R145W, but they were more resistant to the damage of ultraviolet energy than wild type. After the four mutants were overexpressed in HeLa cells, W59C and W151C showed obvious aggregation in the cell. This may be related to their solubility and consistent with the results of protein levels, suggesting that the decline in solubility may be the cause of the cataract at birth. These results indicate that the N-terminal mutation of 尾 B2 crystallin will affect the oligomerization of 尾 B2, and the tryptophan residue mutation at the hydrophobic core will significantly affect the solubility and stability of 尾 B2 crystallin. When the hydrophilic amino acids on the surface of domain mutated to tryptophan, the stability of protein was decreased and protein aggregation was promoted. It is concluded that the pathogenesis of congenital cataract caused by 尾 B2 crystallin gene mutation is diverse.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R776.1

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本文編號：2113628