本文選題：氯離子通道ClC-2 + 青光眼��； 參考：《吉林大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：原發(fā)性開角型青光眼（Primary Open-Angle Glaucoma，POAG）是由于眼內(nèi)壓升高而引起的一種不可逆的致盲眼病，其致病機(jī)制與小梁細(xì)胞形態(tài)、骨架結(jié)構(gòu)及生理功能密切相關(guān)。近期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，能引起眼壓升高，有可能誘發(fā)原發(fā)性開角型青光眼。 氯離子通道家族具有調(diào)控生物體內(nèi)細(xì)胞的興奮度、跨上皮細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、pH值及生物體內(nèi)細(xì)胞容積等多種功能，另外還對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡及免疫應(yīng)答等生理功能有著一定的調(diào)控作用。電壓門控性氯離子通道(Voltage-Gated Chloride Channel，簡(jiǎn)稱ClC)是氯離子通道家族的一員，目前共發(fā)現(xiàn)9種ClC型氯離子通道，ClC-2是ClC型氯離子通道中的一種。本項(xiàng)目組已證實(shí)ClC-2存在于小梁細(xì)胞，并且能調(diào)控小梁細(xì)胞多項(xiàng)生理活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，觀察ClC-2表達(dá)與小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的關(guān)系，并探討ClC-2對(duì)小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)影響的作用機(jī)制。 方法： 1）ClC-2-siRNA設(shè)計(jì)、合成及活性篩選：根據(jù)ClC-2基因mRNA序列，利用計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件設(shè)計(jì)合成ClC-2-siRNA，利用Realtime-PCR，Western Blot技術(shù)檢測(cè)ClC-2-siRNA對(duì)ClC-2表達(dá)的影響。 2）ClC-2對(duì)人小梁細(xì)胞骨架的影響：利用Real time-PCR，WesternBlot及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)ClC-2-siRNA對(duì)Actin，Vinculin，β-catenin表達(dá)的影響。 3）ClC-2對(duì)人小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)影響的機(jī)制研究：構(gòu)建人小梁細(xì)胞體外青光眼模型；利用Real time-PCR，Western Blot檢測(cè)體外青光眼模型小梁細(xì)胞ClC-2的表達(dá)；利用Western Blot檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)。 結(jié)果： 1）本實(shí)驗(yàn)引進(jìn)美國(guó)ScienCell公司的正常人小梁細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，，并且應(yīng)用了相應(yīng)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞單層螺旋狀排列，為梭形，生長(zhǎng)良好，成功進(jìn)行了傳代及凍存，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了良好基礎(chǔ)。由于目前沒有特異的針對(duì)ClC-2的阻斷劑,為了研究ClC-2的活性與小梁細(xì)胞骨架的關(guān)系，因此我們應(yīng)用了RNAi干擾技術(shù)。根據(jù)ClC-2基因序列和RNAi的設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用siRNA設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)了ClC-2-siRNA1，ClC-2-siRNA2.同時(shí)本文針對(duì)ClC-2-siRNA1設(shè)計(jì)了反相siRNA(scRNA)作為對(duì)照。結(jié)果證實(shí)ClC-2-siRNA最佳的轉(zhuǎn)染濃度是100pmol，最佳作用時(shí)間是轉(zhuǎn)染后24h。ClC-2-siRNA1對(duì)ClC-2mRNA及蛋白表達(dá)的抑制效果優(yōu)于ClC-2-siRNA2。 2）小梁細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)是維持小梁細(xì)胞功能的重要基礎(chǔ)。我們主要研究ClC-2活性與小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)是否存在某種關(guān)聯(lián)，是否與原發(fā)性開角型青光眼的發(fā)病機(jī)制有關(guān)系？肌動(dòng)蛋白和粘著斑蛋白是小梁細(xì)胞主要的骨架蛋白，β-鏈蛋白是一種黏附因子，能增加細(xì)胞之間的粘合程度。我們用免疫熒光染色技術(shù)、RT-PCR、Western Blot的方法對(duì)比了正常小梁細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的小梁細(xì)胞骨架的變化，以及肌動(dòng)蛋白、粘著斑蛋白和β-鏈蛋白表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的小梁細(xì)胞的細(xì)胞骨架受到了一定的影響，細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白發(fā)生紊亂，肌動(dòng)蛋白肌絲出現(xiàn)了扭曲交聯(lián)，微絲雖然增加但失去了正常的排列。黏著斑蛋白排列發(fā)生了變化，無(wú)法沿著肌動(dòng)蛋白微絲進(jìn)行有序排列。同時(shí)轉(zhuǎn)染后的小梁細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白、粘著斑蛋白和β-鏈蛋白的蛋白含量、mRNA表達(dá)較正常增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3）小梁細(xì)胞體外青光眼模型的細(xì)胞形態(tài)與正常小梁細(xì)胞區(qū)別不大，主要是細(xì)胞體積略大，核偏圓，排列略顯不規(guī)則。我們應(yīng)用RT-PCR、Western Blot的方法檢測(cè)體外青光眼模型小梁細(xì)胞的ClC-2的表達(dá)較正常小梁細(xì)胞下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其肌動(dòng)蛋白、粘著斑蛋白和β-鏈蛋白的蛋白含量、mRNA表達(dá)較正常增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）在POAG發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，為了探討ClC-2活性對(duì)小梁細(xì)胞骨架影響的機(jī)制，我們應(yīng)用RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)了ClC-2-siRNA轉(zhuǎn)染后的小梁細(xì)胞TGF-β和Smad2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ClC-2-siRNA轉(zhuǎn)染后的小梁細(xì)胞的TGF-β和Smad2的表達(dá)較正常小梁細(xì)胞增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)TGF-β/Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在ClC-2對(duì)小梁細(xì)胞骨架影響過程中發(fā)揮了重要作用。 結(jié)論： 1）ClC-2對(duì)人小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。 2）ClC-2對(duì)人小梁細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)具有的保護(hù)作用可能與TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)
[Abstract]:Primary Open - Angle glaucoma ( POAG ) is an irreversible blindness caused by elevated intraocular pressure . The pathogenesis of primary open - angle glaucoma is closely related to the morphology , skeletal structure and physiological function of trabecular cells . Recently , there have been reported abnormal changes in the cytoskeletal structure of small beam , which can cause elevation of intraocular pressure , and may induce primary open - angle glaucoma .

ClC - 2 is a member of chloride channel family . It has been found that ClC - 2 is a member of chloride channel family .

Method :

1 ) ClC - 2 - siRNA design , synthesis and activity screening : According to ClC - 2 gene mRNA sequence , ClC - 2 - siRNA was synthesized by computer - related software design , and the effects of ClC - 2 - siRNA on ClC - 2 expression were detected by using Realtime - PCR and Western Blot .

2 ) The effect of ClC - 2 on the cytoskeletal structure of human trabecular : The effects of ClC - 2 - siRNA on the expression of Actin , 尾 - catenin were detected by Real time - PCR , Western Blot and immunofluorescence technique .

3 ) The mechanism of ClC - 2 on the structure of human trabecular cells : A model of human trabecular cell in vitro glaucoma was constructed .
The expression of ClC - 2 was detected by Real time - PCR and Western Blot .
The expression of TGF - 尾 / Smad signal transduction pathway was detected by Western Blot .

Results :

In order to study the relationship between ClC - 2 - siRNA1 and ClC - 2 - siRNA1 , ClC - 2 - siRNA1 and ClC - 2 - siRNA2 were designed .

2 ) The normal structure of small - beam cytoskeletal structure is an important basis for maintaining the function of small - beam cells . We mainly study the relationship between ClC - 2 activity and the pathogenesis of primary open - angle glaucoma .

3 ) The cell morphology of trabecular cell in vitro was not significantly different from that of normal trabecular cells . It was found that the expression of ClC - 2 in trabecular cells in vitro was significantly smaller than that in normal trabecular cells by RT - PCR and Western Blot .
The expression of TGF - 尾 and Smad2 in small - beam cells transfected with ClC - 2 - siRNA was detected by RT - PCR and Western Blot .

Conclusion :

1 ) ClC - 2 has protective effect on the cytoskeletal structure of human trabecular cell .

2 ) The protective effect of ClC - 2 on the cytoskeletal structure of human trabecular cells may be related to TGF - 尾 / Smad signal transduction pathways .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R775.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2105791