發(fā)布時(shí)間：2018-07-06 17:50

  本文選題：AGEs + 視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞　； 參考：《中南大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景 糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一,而近年來(lái),隨著糖尿病患者的逐年增多,糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者也逐年升高,成為主要致盲性眼病之一。對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制的探討與研究顯得非常重要。以往眾多此方面的研究公認(rèn)的觀點(diǎn)包括血管病變和代謝因素兩方面,近年來(lái)炎癥免疫因素參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)研究越來(lái)越受到關(guān)注。 晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products, AGEs)是糖尿病患者體內(nèi)聚集的特殊產(chǎn)物。它是在體內(nèi)高血糖的環(huán)境下,蛋白質(zhì)緩慢發(fā)生的非酶促糖基化反應(yīng),其主要影響體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)的蛋白如膠原蛋白、晶狀體蛋白,同時(shí)受到血糖濃度的影響，，并且形成后不易降解。AGEs的形成是一個(gè)緩慢的過(guò)程,一旦在體內(nèi)積聚時(shí),即表現(xiàn)出致病的作用。研究表明給予非糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射AGEs后,可出現(xiàn)血視網(wǎng)膜屏障的廣泛滲漏,最終觸發(fā)炎癥免疫反應(yīng),而所形成的血栓導(dǎo)致血管閉塞,使微循環(huán)功能發(fā)生障礙。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)觀察證實(shí),早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的表現(xiàn)類似低度慢性免疫炎癥對(duì)組織的損傷。同時(shí)抗炎癥或炎癥因子的藥物如糖皮質(zhì)激素、非甾體類消炎藥等可減輕炎癥反應(yīng),改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理改變。AGEs作為糖尿病視網(wǎng)膜病變致病的重要因素,是如何在免疫炎癥的發(fā)病機(jī)制中起作用,至今研究尚未清楚。 視網(wǎng)膜由多種不同類型的細(xì)胞所構(gòu)成。小膠質(zhì)細(xì)胞是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)子抵御病原體入侵的第一防線,被認(rèn)為是CNS中最具有代表性的免疫細(xì)胞。視網(wǎng)膜是CNS是眼部的延續(xù),視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜固有的免疫活性細(xì)胞。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium, RPE)形成視網(wǎng)膜的外屏障,其在高糖環(huán)境下的變化對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病有著非常重要的作用,但是目前對(duì)RPE細(xì)胞功能和免疫學(xué)特性的研究較少。T淋巴細(xì)胞并不是視網(wǎng)膜的固有細(xì)胞,但是在炎癥免疫反應(yīng)中起核心作用。近年來(lái)的研究已經(jīng)使人們認(rèn)識(shí)到,晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變有著非常關(guān)鍵的作用。那么在糖尿病視網(wǎng)膜病變中,AGEs是如何作用于視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,從而激活T淋巴細(xì)胞,引起一系列的免疫應(yīng)答,尚不是很清楚。 我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的免疫機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。我們的研究發(fā)現(xiàn)：(1)AGEs可刺激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)揮抗原遞呈細(xì)胞的作用,通過(guò)提供活化T淋巴細(xì)胞的第一信號(hào)和第二信號(hào),使T淋巴細(xì)胞活化。(2)但視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞比視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)的抗原遞呈作用,所以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞只是一種很弱的抗原遞呈細(xì)胞。(3)所以在AGEs的刺激下,與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞比視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞更能激活T淋巴細(xì)胞的活性。(4)T淋巴細(xì)胞激活后主要是向TH1,TH2兩個(gè)方向分化,我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在AGEs的刺激下,T淋巴細(xì)胞主要的活化方向是向TH1方向活化,促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng),導(dǎo)致視網(wǎng)膜自身免疫破壞。 目的 1探討AGEs對(duì)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)免疫相關(guān)因子的作用。 2探討AGEs對(duì)T淋巴細(xì)胞活性的影響。 3研究視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在AGEs環(huán)境下對(duì)T淋巴細(xì)胞的影響。 方法 1利用熒光定量PCR技術(shù),測(cè)定在不同濃度的AGEs (0ug/ml, 10ug/ml,50ug/ml,100ug/ml,500 ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ, ICAM-1,CD80和CD86的mRNA水平的變化。同時(shí)利用Western-blot方法,檢測(cè)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ, ICAM-1,CD80和CD86的組織蛋白水平的變化。 2利用熒光定量PCR技術(shù),測(cè)定在不同濃度的AGEs (0ug/ml, 10ug/ml,50ug/ml, 100ug/ml,500 ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ, ICAM-1, CD80和CD86的mRNA水平的變化。同時(shí)利用Western-blot方法,檢測(cè)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免疫調(diào)控因子MHCⅡ, ICAM-1, CD80, CD86的組織蛋白水平的變化。 3在不同濃度的AGEs (0,10,50,100,500ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定活化的T淋巴細(xì)胞。利用Western-blot方法,測(cè)定在不同濃度的AGEs (0ug/ml, 10ug/ml, 50ug/ml, 100ug/ml,500 ug/ml)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)控因子IFN-γ, IL-2, IL-10和IL-4的組織蛋白水平的變化 4共培養(yǎng)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞,分別在AGEs(0,10, 50,100,500 ug/ml)培養(yǎng),流式細(xì)胞儀測(cè)定活化的T淋巴細(xì)胞。 5共培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞,分別在AGEs (0, 10,50,100,500ug/ml)培養(yǎng),流式細(xì)胞儀測(cè)定活化的T淋巴細(xì)胞。 結(jié)果 1.視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ, ICAM-1, CD80和CD86的表達(dá)經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè),正常培養(yǎng)組的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有以上細(xì)胞因子的表達(dá)；經(jīng)AGEs刺激24 h后,視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ, IL-1β, ICAM-1, CD80和CD86的表達(dá)明顯上調(diào),且這些變化具有劑量依賴性,與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞MHCⅡ, ICAM-1, CD80和CD86的表達(dá)經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè),正常培養(yǎng)組的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞有以上細(xì)胞因子的表達(dá)；經(jīng)AGEs刺激24 h后,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞MHCⅡ, ICAM-1的表達(dá)明顯上調(diào),且這些變化具有劑量依賴性,與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)沒(méi)有明顯變化,與空白組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),組間比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.在T淋巴細(xì)胞和人視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)之后測(cè)定,陽(yáng)性對(duì)照組的T淋巴細(xì)胞被激活,隨著AGEs濃度的增加,表達(dá)CD69,CD3的陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞百分比漸增。T淋巴細(xì)胞IFN-γ,IL-2,IL-4和IL-10的表達(dá)經(jīng)Western-blot檢測(cè),正常培養(yǎng)組的T淋巴細(xì)胞有以上細(xì)胞因子的表達(dá);經(jīng)AGEs刺激24 h后,T淋巴細(xì)胞IFN-γ,IL-2的表達(dá)明顯上調(diào),且這些變化具有劑量依賴性；而T淋巴細(xì)胞IL-4和IL-10的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。 4.在T淋巴細(xì)胞和人視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)之后測(cè)定,陽(yáng)性對(duì)照組的T淋巴細(xì)胞被激活,隨著AGEs濃度的增加,表達(dá)CD69和CD3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞百分比漸增。 5.在T淋巴細(xì)胞和人視網(wǎng)膜色素上能上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)之后測(cè)定,陽(yáng)性對(duì)照組的T淋巴細(xì)胞被激活,隨著AGEs濃度的增加,表達(dá)CD69和CD3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞百分比漸增。 結(jié)論： 1AGEs可提高視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ, ICAM-1, CD80和CD86的表達(dá),激活視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫活性。 2AGEs可提高視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞MHCⅡ, ICAM-1的表達(dá),激活視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的免疫活性,但不能提高視網(wǎng)膜色素上皮CD80和CD86的表達(dá),所以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞只是弱的抗原遞呈細(xì)胞。 3AGEs激活T淋巴細(xì)胞細(xì)胞的免疫活性,其中可提高T淋巴細(xì)胞IFN-γ, IL-2的表達(dá),但不能提高T淋巴細(xì)胞IL-4和IL-10的表達(dá),所以在AGEs的刺激下,T淋巴細(xì)胞向TH1方向分化。 4視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),在AGEs的刺激下,T淋巴細(xì)胞的活性增強(qiáng)。 5視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),在AGEs的刺激下,T淋巴細(xì)胞的活性增強(qiáng),但T淋巴細(xì)胞活化的程度小于T淋巴細(xì)胞與視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)。
[Abstract]:Background of the study


Diabetic retinopathy ( DR ) is one of the most common complications of diabetes . In recent years , with the increase of the number of patients with diabetes mellitus , the patients with diabetic retinopathy have been increasing year by year .


Advanced Glycation End Products ( AGE ) is a special product of advanced Glycation End Products ( AGE ) in diabetic patients . It is a slowly occurring non - enzymatic glycosylation reaction in the environment of high blood sugar in vivo .


Experimental animal pathology observation confirmed that early diabetic retinopathy showed similar low - degree chronic immune inflammation to the tissue . Meanwhile , drugs such as glucocorticoid , non - steroidal anti - inflammatory drugs , etc . , which were anti - inflammatory or inflammatory factors , could alleviate inflammatory reaction and improve the pathological changes of diabetic retinopathy .


Retinal pigment epithelium ( RPE ) plays a central role in the pathogenesis of diabetic retinopathy , but it plays a central role in the pathogenesis of diabetic retinopathy .


We found that : ( 1 ) The retinal pigment epithelial cells can stimulate the retinal glial cells and the retinal pigment epithelial cells play the role of antigen - presenting cells .


Purpose


1 To investigate the effects of AGE on the expression of immune - related factors in retinal microglial cells and retinal pigment epithelial cells .


2 To investigate the effect of AGE on T lymphocyte activity .


3 . The effect of retinal microglial cells and retinal microglial cells on T lymphocytes was studied .


method


1 . The mRNA levels of MHC 鈪

本文編號(hào)：2103634