本文選題：肺炎嗜衣原體 + Cpn0423��； 參考：《南華大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的: 評(píng)價(jià)肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)假定III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, T3SS )效應(yīng)蛋白Cpn0423和Cpn0710的免疫活性;檢測(cè)其在Cpn感染的人喉癌上皮細(xì)胞(Hep-2)中的定位情況;觀察Cpn0423和Cpn0710蛋白的表達(dá)時(shí)相,為尋找新的Cpn和宿主細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白奠定基礎(chǔ)。 方法: 提取重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0423和pGEX6p-2/Cpn0710,并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Cpn0423和Cpn0710,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡法(Western-Blot)分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物;采用GST純化樹(shù)脂純化重組蛋白,并濃縮純化蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度;重組蛋白皮下注射免疫BALB/c小鼠,制備Cpn0423、Cpn0710多克隆抗體,ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中多克隆抗體的效價(jià),分析重組蛋白的免疫原性;間接免疫熒光法(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)檢測(cè)Cpn0423和Cpn0710蛋白在Cpn感染Hep-2細(xì)胞72h后的定位情況。同時(shí)應(yīng)用IFA觀察Cpn0423和Cpn0710蛋白在Cpn感染細(xì)胞6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h, 120h后不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的變化及Cpn包涵體形態(tài)學(xué)上的變化特征。 結(jié)果: Cpn0423和Cpn0710重組蛋白在E.coli BL21菌中獲得高效表達(dá),Mr分別約為41kDa和35kDa,對(duì)溫度、IPTG和時(shí)間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列的摸索優(yōu)化后,獲得可溶性表達(dá)蛋白;采用GST純化樹(shù)脂純化獲得純度在95%以上的重組蛋白;重組蛋白免疫BALB/c小鼠,間接ELISA檢測(cè)免疫血清特異性抗體,效價(jià)分別為1:16000和1:12000。Cpn成功感染Hep-2細(xì)胞,應(yīng)用IFA檢測(cè)Cpn0423和Cpn0710蛋白定位在宿主細(xì)胞胞漿,觀察了Cpn包涵體隨時(shí)間在感染Cpn細(xì)胞中形態(tài)學(xué)上的變化。 結(jié)論: (1)成功制備并純化Cpn0423和Cpn0710重組蛋白; (2) Cpn0423和Cpn0710能刺激BALB/c小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體,具有較好的免疫原性; (3) Cpn0423和Cpn0710蛋白定位在宿主細(xì)胞胞漿,可能為Cpn分泌性蛋白。
[Abstract]:Objective: to evaluate the immunological activity of type III secretion system (T3SS) effector proteins Cpn0423 and Cpn0710 of Chlamydophila pneumoniae (Cpnae), and to detect the localization of Cpn0423 and Cpn0710 protein in Hep-2 cells, and to observe the expression phase of Cpn0423 and Cpn0710 protein. Methods: Recombinant plasmids pGEX6p-2 / Cpn0423 and pGEX6p-2 / Cpn0710 were extracted and transformed into E. coli BL21 to induce the expression of recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710. the recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710were induced by IPTG. SDS-PAGE and Western blot were used to analyze and identify the expressed products. The recombinant protein was purified by GST purified resin, and the protein concentration was determined by BCA method. The recombinant protein was injected subcutaneously to immunize BALB / c mice, and Cpn0423 (Cpn0710) polyclonal antibody was prepared by Elisa to detect the titer of polyclonal antibody in the serum of immunized mice. The immunogenicity of recombinant protein was analyzed, and the localization of Cpn0423 and Cpn0710 protein in Hep-2 cells was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA). The expression of Cpn0423 and Cpn0710 proteins at different time points after 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h were observed by IFA. Results: the recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710 were highly expressed in E. coli BL21. The expression parameters were 41kDa and 35kDa, respectively. The induced expression conditions such as temperature, IPTG and time were optimized. Soluble expression protein was obtained, recombinant protein with purity above 95% was purified by GST purified resin, recombinant protein was immunized with BALB / c mice, specific antibody of immune serum was detected by indirect Elisa, the titers were 1: 16000 and 1: 12000.Cpn successfully infected Hep-2 cells. Cpn0423 and Cpn0710 proteins were detected by IFA in the cytoplasm of host cells. The morphological changes of CPN inclusion bodies over time in infected CPN cells were observed. Conclusion: the recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710 were successfully prepared and purified, and Cpn0423 and Cpn0710 stimulated BALBr / c mice to produce high titer specific antibodies. Cpn0423 and Cpn0710 proteins were located in the cytoplasm of host cells, which might be CPN secreted proteins.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.65

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本文編號(hào)：1992490