發(fā)布時間：2018-06-03 12:49

  本文選題：鼻咽癌 + miR-21　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：MicroRNAs (miRNAs)是真核生物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA,大約由18-25個核苷酸組成,主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,通過與靶mRNA的3'-UTRs完全或不完全互補結(jié)合,引起靶mRNA的降解或翻譯抑制,在包括器官發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡等生命過程中發(fā)揮著巨大的作用。研究發(fā)現(xiàn)超過50%的microRNA在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點,它們通過對靶mRNA的調(diào)控,影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、血管形成和轉(zhuǎn)移,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段。研究顯示,許多腫瘤組織中microRNA相對于其正常組織表達異常,這些microRNA可作為瘤基因或抑瘤基因,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。 miR-21是人類組織和細胞中較早發(fā)現(xiàn)的microRNA之一,位于17號染色體TMEM49基因編碼區(qū)域內(nèi),全長22個核苷酸,在多種組織中廣泛表達,有其自身的啟動子區(qū)域。目前已證實,miR-21在腦膠質(zhì)瘤、喉癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中異常表達,參與眾多腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管浸潤和轉(zhuǎn)移等過程,介導(dǎo)放療及藥物抵抗,作用機制涉及多條信號通路,其靶基因具有組織特異性,被認(rèn)為是一個潛在的腫瘤治療靶點。 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是發(fā)生于鼻咽粘膜上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病有顯著地理差異,好發(fā)于東南亞及我國南方地區(qū),其中以廣東、廣西、湖南等省發(fā)病率最高。病理類型多為低分化或未分化癌,惡性程度高,侵襲性強,短期可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,Ⅲ～Ⅳ期患者五年生存率僅30%。隨著放射治療技術(shù)的改進、化療及靶向藥物的綜合應(yīng)用,鼻咽癌患者的局部控制率和生存率得到改善,但局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移仍是鼻咽癌治療的瓶頸,缺乏有效的治療手段。腫瘤干細胞假說認(rèn)為,腫瘤組織內(nèi)存在一小部分具有自我更新能力和多向分化潛能的腫瘤干細胞,是腫瘤的“本源”,傳統(tǒng)放療、化療只能殺死已分化或分化中的腫瘤細胞,腫瘤干細胞是腫瘤治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因。大量研究證實上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和遷徙的先發(fā)條件,腫瘤干細胞通常兼有EMT的屬性。上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通常表現(xiàn)為：細胞間粘附減弱；細胞形態(tài)從多邊形向梭形轉(zhuǎn)化；同時伴有上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達下調(diào)和間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherun、Vimentin、Fibronectin等表達上調(diào)。近期研究表明,miR-21在鼻咽癌患者血漿中高表達,且其表達量與腫瘤大小及范圍(T分期)、區(qū)域淋巴結(jié)受累情況(N分期)顯著相關(guān),聯(lián)合測定miR-21等五個microRNA的血漿表達水平可作為鼻咽癌診斷的無創(chuàng)性指標(biāo),其診斷靈敏度為87.7%,特異性為82.0%。然而miR-21在鼻咽癌組織中的表達譜、miR-21在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的作用,目前尚未見報道。 基于miR-21的研究現(xiàn)狀及其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的潛在意義,本課題研究目的為：明確miR-21在鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞株中的表達譜,驗證miR-21在鼻咽癌增殖、凋亡、遷移、侵襲、EMT及放射抵抗性方面的作用并探討其機制。我們通過上調(diào)和下調(diào)miR-21的表達水平明確其對鼻咽癌細胞生物學(xué)行為的影響,隨后進行下游基因的篩選和驗證,初步探討miR-21在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色及其機制,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎(chǔ),為此本課題進行了如下研究： 方法： 1.檢測鼻咽癌組織標(biāo)本及細胞株中miR-21的表達譜 運用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)方法檢測CNE1、CNE2, SUNE1、HONE1、5-8F、6-10B及C666-1共7種鼻咽癌細胞株miR-21的表達譜,以永生化鼻咽上皮細胞株NP69作為對照。收集鼻咽癌組織標(biāo)本48例和慢性鼻咽炎癥組織標(biāo)本20例,運用qRT-PCR方法檢測以上68例組織標(biāo)本中miR-21的表達譜。結(jié)果分析運用2-△△Ct方法進行比較。 2.下調(diào)鼻咽癌細胞中內(nèi)源性miR-21表達水平對鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲、及放射抵抗等生物學(xué)行為的影響 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將化學(xué)合成的miR-21抑制物(miR-21inhibitor)轉(zhuǎn)染至CNE2鼻咽癌細胞中,轉(zhuǎn)染后分別于24小時、48小時、72小時及96小時收集細胞并提取RNA, qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的細胞miR-21表達水平以評價抑制效果。 生長曲線(MTT法)檢測下調(diào)miR-21表達后細胞體外增殖能力的改變。 流式細胞技術(shù)檢測下調(diào)miR-21表達后細胞凋亡情況的改變。 細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗檢測下調(diào)miR-21表達后細胞體外遷移能力的改變；Boyden小室實驗檢測下調(diào)miR-21表達后細胞體外侵襲能力的改變。 Western Blot從蛋白水平檢測下調(diào)miR-21表達后細胞EMT相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表達水平的變化。 直線加速器照射不同處理組鼻咽癌細胞株后,運用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡情況。 直線加速器照射不同處理組鼻咽癌細胞株后,運用克隆形成實驗檢測細胞克隆形成情況。 3.上調(diào)鼻咽癌細胞中miR-21表達水平驗證miR-21如上功能 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將化學(xué)合成的miR-21模擬物(miR-21mimics)轉(zhuǎn)染至6-10B鼻咽癌細胞中,轉(zhuǎn)染后分別于24小時、48小時、72小時及96小時收集細胞并提取RNA, qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的細胞miR-21表達水平以評價過表達效果。 生長曲線(MTT法)檢測上調(diào)miR-21表達后細胞體外增殖能力的改變。 流式細胞技術(shù)檢測上調(diào)miR-21表達后細胞凋亡情況的改變。 細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗檢測上調(diào)miR-21表達后細胞體外遷移能力的改變；Boyden小室實驗檢測上調(diào)miR-21表達后細胞體外侵襲能力的改變。 Western Blot從蛋白水平檢測上調(diào)miR-21表達后細胞EMT相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表達水平的變化。 直線加速器照射不同處理組鼻咽癌細胞株后,運用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡情況。 直線加速器照射不同處理組鼻咽癌細胞株后,運用克隆形成實驗檢測細胞克隆形成情況。 4.初步篩查鼻咽癌細胞中miR-21的下游蛋白 Western Blot從蛋白水平檢測干擾CNE2、6-10B鼻咽癌細胞miR-21表達水平后PTEN、PDCD4、RECK表達水平的變化。結(jié)果： 1.鼻咽癌組織標(biāo)本和細胞株中miR-21的表達譜 運用qRT-PCR方法檢測48例鼻咽癌組織和20例慢性鼻咽炎癥組織中miR-21的表達,結(jié)果顯示,與慢性鼻咽炎癥組織相比,鼻咽癌組織中miR-21的表達水平明顯上調(diào)(圖1A,P0.001),且miR-21的表達水平與腫瘤大小及范圍(T分期,P=0.0223)、區(qū)域淋巴結(jié)受累情況(N分期,P=0.0012)及臨床分期(P=0.0266)顯著相關(guān)(表1)。qRT-PCR方法檢測CNE1、CNE2. SUNE1、HONE1、5-8F.6-10B及C666-1共7種鼻咽癌細胞株miR-21的表達譜,以永生化鼻咽上皮細胞株NP69作為對照。結(jié)果顯示,miR-21在CNE2、SUNE1、HONE1、5-8F及C666-1等5種鼻咽癌細胞株中的表達水平高于NP69(圖1B,P0.05),而miR-21在CNE1、6-10B兩種細胞株中的表達水平略低于NP69,其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B,P0.05)。 2.干擾鼻咽癌細胞中內(nèi)源性miR-21表達水平對鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲及放射抵抗等生物學(xué)行為的影響 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將化學(xué)合成的miR-21抑制物(miR-21inhibitor)導(dǎo)入CNE2鼻咽癌細胞中,同時將miR-21模擬物(miR-21mimics)導(dǎo)入6-10B鼻咽癌細胞中,分別于轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時、96小時收集細胞并提取RNA, qRT-PCR檢測各組細胞miR-21的表達,結(jié)果顯示,與各自的對照組(NC)相比,miR-21的抑制及過表達效率在轉(zhuǎn)染后96小時仍達80%以上,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)(圖2A、B)。 2.1細胞增殖 生長曲線(MTT法)實驗結(jié)果表明下調(diào)miR-21表達可抑制CNE2細胞體外增殖(圖3A),而上調(diào)miR-21表達可促進6-10B細胞體外增殖(圖3B)。 2.2細胞凋亡 凋亡實驗結(jié)果表明下調(diào)miR-21表達后CNE2細胞凋亡比例增加,而上調(diào)miR-21表達后6-10B細胞凋亡比例減少(圖4,表2)。 2.3細胞遷移能力 細胞劃痕實驗、Transwell小室實驗結(jié)果均表明下調(diào)miR-21表達水平后CNE2細胞體外遷移能力減弱(圖5A、C)。然而上調(diào)miR-21表達水平后6-10B細胞的體外遷移能力增強(圖5B、D)。 2.4細胞侵襲能力 Boyden小室實驗結(jié)果顯示,下調(diào)miR-21表達水平減弱了CNE2細胞體外侵襲能力(圖6A)。上調(diào)miR-21表達水平則促進6-10B細胞體外侵襲能力(圖6B)。 2.5EMT相關(guān)基因表達 Western Blot從蛋白水平檢測干擾miR-21表達水平后細胞EMT相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達水平的變化。結(jié)果顯示,抑制miR-21后CNE2細胞的E-cadherin表達水平上調(diào),N-cadherin、Vimentin表達水平下調(diào)(圖7A)；過表達miR-21后6-10B細胞的E-cadherin表達水平下調(diào),與此同時N-cadherin、Vimentin表達水平上調(diào)(圖7B)。以上實驗表明,miR-21促進鼻咽癌細胞發(fā)生EMT。 2.6細胞放射抵抗性 對照組及實驗組細胞均接受8Gy放療照射后24小時,運用流式細胞分析儀檢測不同處理組間細胞凋亡比例的變化。結(jié)果顯示,抑制miR-21后CNE2細胞的凋亡比例增加(P=0.0220)；過表達miR-21后6-10B細胞的凋亡比例減少(P=0.0390)(圖8)。 對照組及實驗組細胞均接受8Gy放療照射后24小時,進行克隆形成實驗檢測不同處理組細胞克隆形成能力的變化。結(jié)果顯示,抑制miR-21后CNE2細胞的克隆形成數(shù)量減少(P=0.0236)(圖9A、C)；過表達miR-21后6-10B細胞的克隆形成數(shù)量增多(P=0.0158)(圖9B、C)。 以上實驗表明,miR-21增加鼻咽癌細胞的放射抵抗性。 3.初步篩查鼻咽癌細胞中miR-21的下游蛋白 Western Blot檢測miR-21抑制實驗及過表達實驗后,細胞PTEN、PDCD4、 RECK蛋白水平的變化。結(jié)果顯示,抑制miR-21后CNE2細胞的PTEN表達水平無明顯變化,過表達miR-21后6-10B細胞的PTEN表達水平亦無明顯變化。抑制miR-21后CNE2細胞的PDCD、RECK表達水平上調(diào),與此同時過表達miR-21后6-10B細胞的PDCD4、RECK表達水平下調(diào)(圖10),提示在鼻咽癌細胞中,miR-21抑制PDCD4及RECK蛋白的表達。 結(jié)論： 相對于慢性鼻咽炎癥組織,miR-21在鼻咽癌組織標(biāo)本中表達升高,且表達量與腫瘤T分期、N分期及臨床分期呈正相關(guān)。相對于NP69, miR-21在CNE2、SUNE1、HONE1、5-8F及C666-1等5種鼻咽癌細胞株中的表達水平增高。細胞體外實驗證實,miR-21減少鼻咽癌細胞凋亡,促使鼻咽癌細胞發(fā)生EMT,促進鼻咽癌細胞增殖、遷移及侵襲,增加其放射抵抗性。miR-21在鼻咽癌細胞中抑制PDCD4及RECK蛋白的表達。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Stella Chai;Stephanie Ma;;Clinical implications of microRNAs in liver cancer stem cells[J];癌癥(英文版);2013年08期

2 孫衍昶;郭t$t$;賽克;王翦;王潔;陳芙蓉;張宗平;陳忠平;;MicroRNA-181b提高U87細胞對VM-26的敏感性研究[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2013年02期

3 丁明建;王聞?wù)?王孝舉;;MicroRNA在肺癌中的表達及其臨床意義[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2013年12期

4 劉笙腩;顏潤川;李玲玲;張雅妹;陳樹林;趙善廷;;miRNA-34c實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2013年11期

5 孫文婷;趙莉;喻田;;MicroRNA在預(yù)處理心肌保護中的研究進展[J];貴州醫(yī)藥;2013年11期

6 楊淵;毛慶;;MicroRNAs在膠質(zhì)瘤治療中的作用及研究進展[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2013年03期

7 張芳;李洋;周清華;;MicroRNA與肺癌順鉑耐藥相關(guān)性研究進展[J];中國肺癌雜志;2014年03期

8 羅陽;韓子午;田男;;miRNA與常見肝病發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進展[J];浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2014年01期

9 王利平;王啟之;;miRNA實驗技術(shù)及與消化道腫瘤關(guān)系的研究進展[J];國際消化病雜志;2014年01期

10 張家仕;李立平;冼紹祥;;微小RNA與心血管疾病相關(guān)性研究進展[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年06期

相關(guān)會議論文 前2條

1 Xiaoxia Liu;Li Liu;Qian Xu;Ping Wu;Xialin Zuo;Aimin Ji;;MicroRNA as a novel drug target for cancer therapy[A];2013年廣東省藥師周大會論文集[C];2013年

2 姜敏;張偉;;Micro-RNA作為人類上皮組織惡性腫瘤診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物的應(yīng)用價值[A];江西省第二次中西醫(yī)結(jié)合呼吸疾病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陰棉棉;小鼠卵泡發(fā)育過程中MiRNA-383和MiRNA-320的功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

2 唐曦平;靶向干擾ghrelin基因?qū)毙砸认傺滓认傧倥菁毎装Y與鈣通路的調(diào)節(jié)機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

3 李奕;不同強度運動誘導(dǎo)mTOR信號對心肌肥大的作用研究[D];北京體育大學(xué);2013年

4 常靚;胃癌中microRNA-200家族的表達及其功能的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

5 黃愛優(yōu);三角褐指藻miRNA篩選、作用機制及代謝流量分析[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2013年

6 賈曉健;以HDL受體SR-BI基因3'UTR為靶點的microRNA和小分子化合物的發(fā)現(xiàn)及作用機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

7 陳婷;microRNA-155調(diào)控oxLDL刺激樹突細胞參與動脈粥樣硬化免疫炎癥反應(yīng)的作用及機制[D];浙江大學(xué);2013年

8 姚明;肺癌轉(zhuǎn)移動物模型的建立及活體成像觀察[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

9 劉雪會;單核苷酸多態(tài)性和miRNA對CARM1基因表達的調(diào)控機制及其在冠心病中的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

10 張緒森;miRNA-200b影響失巢凋亡的機制及其表達的自我調(diào)節(jié)[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王欣萍;基于酶催化信號放大策略檢測microRNA的新技術(shù)研究[D];華東理工大學(xué);2013年

2 申璐;miR-21與MAPKs信號通路反饋調(diào)控在亞砷酸鈉所致HELF細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

3 劉慧;MicroRNA-182對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展，，預(yù)后以及細胞遷移能力的研究[D];山東大學(xué);2013年

4 劉紀(jì)雷;OSU03012聯(lián)合Wortmannin對舌鱗癌細胞Tca8113增殖活性及SHIP2蛋白表達的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

5 賈勐;microRNA-21在甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1中的作用[D];鄭州大學(xué);2013年

6 汪寧;MiR-205對前列腺癌增殖與轉(zhuǎn)移功能學(xué)及分子機制學(xué)影響的研究探討[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

7 楊偉;TPM1在膽管癌中的表達及其調(diào)控機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

8 曹影;miR-137對人喉癌細胞株Hep-2細胞增殖的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

9 楊q

本文編號：1972836