本文選題：慢病毒 + 角膜基質(zhì)��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的:觀察以慢病毒作為載體,介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(lenti-EGFP)這一報(bào)告基因,通過兩種方式體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞的有效性和安全性,探索一種簡便,有效且安全的轉(zhuǎn)染載體及途徑,為角膜相關(guān)疾病的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:Lenti-EGFP通過兩種不同方法體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞,途徑1:將Lenti-EGFP病毒液通過微量進(jìn)樣器直接注射進(jìn)角膜基質(zhì);途徑2:刮除角膜上皮,基質(zhì)層敷貼浸帶有等量lenti-EGFP病毒液的棉片。轉(zhuǎn)染后定期裂隙燈檢查,觀察角膜綠色熒光的表達(dá)及外眼情況,以3d、7d、26d、48d四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集角膜,固定后切片,進(jìn)行HE染色,觀察角膜各層細(xì)胞的大體形態(tài);共聚焦顯微鏡觀察拍照,了解角膜熒光表達(dá)的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間及分布情況;電鏡觀察基質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;細(xì)胞凋亡檢測(cè),了解試驗(yàn)組與對(duì)照組角膜細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果:1.裂隙燈古蘭光下見轉(zhuǎn)染lenti-EGFP的活體大鼠角膜成藍(lán)綠色,對(duì)照組角膜未見熒光表達(dá)。2.HE染色顯示各組別大鼠角膜的各層細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯異常改變,電鏡見實(shí)驗(yàn)組角膜基質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生變異。3.共聚焦顯微鏡下觀察見:轉(zhuǎn)染lenti-EGFP的角膜基質(zhì)細(xì)胞2d后增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)開始表達(dá),7d時(shí)熒光表達(dá)到高峰,全層角膜均可見熒光表達(dá),26d時(shí)表達(dá)明顯減弱,48d時(shí)僅是上皮有微弱表達(dá);空質(zhì)粒組在第3d和7d時(shí)角膜上皮及基質(zhì)層間可見微弱熒光,基質(zhì)細(xì)胞中無熒光表達(dá),26d和48d時(shí)角膜已無熒光表達(dá);對(duì)照組的全層角膜在各時(shí)間段均未見熒光表達(dá)。4.Tunel檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的角膜上皮及基質(zhì)細(xì)胞凋亡率較正常組高,但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:Lenti-EGFP通過上述兩種體內(nèi)轉(zhuǎn)染途徑均可安全有效的轉(zhuǎn)染活體大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染初期,注射法的EGFP基因表達(dá)更強(qiáng),隨著時(shí)間的延長兩種方式的熒光強(qiáng)度趨于相同,但基質(zhì)注射途徑仍略強(qiáng)于刮除上皮敷貼棉片這種方式。兩種技術(shù)操作簡便、基因轉(zhuǎn)染快速,且轉(zhuǎn)染效率較高、安全性好,為各種原因?qū)е碌慕悄げ∽?尤其是對(duì)抑制準(zhǔn)分子激光術(shù)后角膜Haze形成及板層角膜移植術(shù)后的排斥反應(yīng)等轉(zhuǎn)基因治療提供了新思路。
[Abstract]:Objective: to investigate the efficacy and safety of lenti-EGFP gene mediated by lentivirus in rat corneal stromal cells. Effective and safe transfection vectors and pathways provide experimental basis for gene therapy of corneal related diseases. Methods Twenty Lenti-EGFP methods were used to transfect rat corneal stromal cells in vivo. Route 1: Lenti-EGFP virus solution was injected directly into corneal stroma through microsampler, and route 2: corneal epithelium was scraped and stromal layer was coated with cotton flakes containing the same amount of lenti-EGFP virus solution. After transfection with slit lamp, the expression of green fluorescence in cornea and the condition of external eye were observed. The cornea were collected at 4 different time points (3 days, 7 days, 26 days, 48 days), fixed sections were stained with HE, and the gross morphology of the cells in each layer of cornea was observed. The intensity, duration and distribution of fluorescence expression in cornea were observed by confocal microscope. Ultrastructural changes of stromal cells were observed by electron microscope. Apoptosis was detected in experimental group and control group. The result is 1: 1. Under slit lamp Gulan light, the cornea of living rats transfected with lenti-EGFP became blue-green, while that of control group showed no fluorescence expression .2.HE staining showed that the morphology of all layers of cornea in each group did not change abnormally. The ultrastructure of corneal stromal cells in the experimental group was not changed. Under confocal microscope, the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) reached its peak at 7 days after transfection of lenti-EGFP into corneal stromal cells. Fluorescence expression was observed in the whole cornea at day 26, and the expression was weakly expressed in the epithelium at the 48d, and between the epithelium and the stroma on the 3rd and 7th day in the blank plasmid group, and there was weak fluorescence between the epithelium and the stromal layer in the blank plasmid group. No fluorescent expression was found in the stromal cells at day 26 and day 48, but no fluorescence expression was found in the whole cornea of the control group. 4. Tunel analysis showed that the apoptosis rate of corneal epithelium and stromal cells in the experimental group was higher than that in the normal group. But there was no significant difference between the control group and the control group (P 0.05). ConclusionTwo percent Lenti-EGFP can be used to transfect rat corneal stromal cells safely and effectively through the two in vivo transfection pathways. In the early stage of transfection, the EGFP gene expression was stronger, and the fluorescence intensity of the two methods tended to be the same with time, but the matrix injection pathway was still slightly stronger than that of scraping epithelium coated cotton flakes. The two techniques are easy to operate, rapid gene transfection, high transfection efficiency and good safety. In particular, it provides a new way to inhibit the formation of corneal Haze and the rejection of lamellar keratoplasty after excimer laser surgery.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R779.63

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本文編號(hào)：1901942