本文選題：硫醇轉(zhuǎn)移酶 + 糖尿病性白內(nèi)障　； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的:硫醇轉(zhuǎn)移酶(Thioltransferase,TTase)對(duì)維持晶狀體氧化還原平衡狀態(tài)有重要作用。本研究通過觀察糖尿病性白內(nèi)障和年齡相關(guān)性白內(nèi)障,及不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜中TTase含量與活性,分析其與臨床資料的相關(guān)性,探討硫醇轉(zhuǎn)移酶在糖尿病性白內(nèi)障形成中可能的作用。建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠白內(nèi)障的模型,觀察大鼠晶狀體的形態(tài)和相關(guān)生化指標(biāo)改變與TTase變化的關(guān)系,進(jìn)一步探討TTase在糖尿病性白內(nèi)障形成中的作用;采用不同濃度和時(shí)間高糖處理晶狀體上皮細(xì)胞,觀察細(xì)胞TTase表達(dá)和活性的變化,研究與細(xì)胞生化指標(biāo)和凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系,探討TTase在高糖引起的細(xì)胞氧化損傷中可能的作用。方法:1.分別收集行白內(nèi)障超聲乳化術(shù)的糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜108例和年齡相關(guān)性白內(nèi)障108例,分40-55歲,56-65歲,66-80歲三個(gè)年齡段,Western blot檢測(cè)晶狀體前囊膜TTase蛋白質(zhì)的含量,TTase活性及谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量;分析糖尿病性白內(nèi)障晶狀體前囊膜TTase活性與患者年齡、病程、視力、血糖、糖化血紅蛋白、GSH等資料的相關(guān)性;分析50-60歲年齡相關(guān)性白內(nèi)障(核性、皮質(zhì)性和混合性白內(nèi)障)晶狀體前囊膜的TTase表達(dá)和活性[1]。2.取雄性SD大鼠30只,隨機(jī)分為2組,隨機(jī)選擇15只為糖尿病組,按65mg/kg的劑量給予注射鏈脲佐菌素(STZ),溶解于0.02 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液,對(duì)照組給予注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。STZ后72小時(shí),血糖濃度達(dá)到16.7 mmol/L認(rèn)為造模成功;定期監(jiān)測(cè)各組大鼠體重、血糖,每周用1%濃度復(fù)方托品酰胺眼液散瞳后,在裂隙燈下觀察并記錄其晶狀體混濁程度的變化情況。12周后處死大鼠,取出眼球,分離晶狀體,放-80℃?zhèn)溆谩estern blot檢測(cè)兩組大鼠的晶狀體中TTase表達(dá),用試劑檢測(cè)其活性的變化。采用DTNB顯色法測(cè)量和計(jì)算晶狀體中GSH及GSSG的含量。SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析TTase與晶狀體混濁程度、GSH、GSSG的關(guān)系。3.將晶狀體上皮細(xì)胞(HLE B3)系用不同濃度葡萄糖培養(yǎng)(5.5m M、15.5m M,25.5m M和35.5m M葡萄糖和高滲甘露醇對(duì)照組)。高糖刺激細(xì)胞24小時(shí)后搜集細(xì)胞,檢測(cè)TTase表達(dá),建立濃度曲線。根據(jù)濃度梯度結(jié)果,選擇35.5m M葡萄糖為實(shí)驗(yàn)濃度處理晶狀體上皮細(xì)胞,分別在0h,2h,8h,16h,24h時(shí)間點(diǎn)搜集細(xì)胞,檢測(cè)TTase表達(dá)和活性,建立時(shí)間曲線。同時(shí)檢測(cè)0h,2h,8h,16h,24h細(xì)胞GSSG和GSH,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)與凋亡相關(guān)的蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果:1.TTase活性在40-55歲組糖尿病晶狀體前囊膜中(2.36±0.78 m U/mg protein)表達(dá)高于同齡組年齡相關(guān)性白內(nèi)障組(2.64±0.83 m U/mg protein)(P0.05),而在56歲以上組間無顯著性差異;TTase蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果與活性相似;多因素相關(guān)性分析顯示TTase蛋白質(zhì)表達(dá)和活性與糖尿病患者的年齡(R=-0.755)、病程(R=-0.515)、糖化血紅蛋白(R=-0.607)、糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度(R=-0.438)、GSH(R=0.730)和GSSG(R=-0.438)相關(guān),與空腹血糖(R=-0.147)、視力(R=0.199)、白內(nèi)障類型(R=-0.134)無關(guān);不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障:皮質(zhì)性(2.24±0.87 m U/mg protein)、核性(2.14±0.61 m U/mg protein)和混合性(2.09±0.76 m U/mg protein)白內(nèi)障晶狀體前囊膜中TTase活性無顯著性差異[1]。2.注射STZ后72小時(shí),糖尿病組大鼠血糖較正常對(duì)照組顯著增高(P0.01),并出現(xiàn)多飲、體重下降。散瞳裂隙燈下觀察結(jié)果顯示,STZ注射后第4周,糖尿病大鼠晶狀體逐漸開始發(fā)生混濁,第8周之前晶狀體混濁程度進(jìn)展比較緩慢,8周以后混濁快速進(jìn)展。正常組大鼠體重始終保持較高水平,糖尿病大鼠體重較對(duì)照組低(P0.01),4周以后晶狀體混濁程度明顯重于對(duì)照組大鼠(P0.05),正常對(duì)照組大鼠晶狀體始終保持透明。12周后檢測(cè)晶狀體GSH的含量糖尿病組(28.31±4.76 umol/g protein)較對(duì)照組(52.97±6.44 umol/g protein)下降了約50%(P0.05),GSSG含量(6.94±1.40 umol/g protein)則較對(duì)照組(2.03±0.45 umol/g protein)顯著增加(P0.05)。Western blot顯示,糖尿病組大鼠晶狀體TTase的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P0.05),活性(0.81±0.27U/g protein)也明顯低于對(duì)照組(1.26±0.29U/g protein)(P0.05),且與GSH正相關(guān)(R=0.593,P0.05),與晶狀體混濁程度和GSSG呈負(fù)相關(guān)(R=-0.541,P0.05)。3.TTase蛋白質(zhì)表達(dá)隨葡萄糖濃度增加逐漸增強(qiáng),在35.5 m M葡萄糖組中最強(qiáng),高滲對(duì)照組甘露醇組無明顯變化。TTase活性在35.5 m M葡萄糖處理后2h開始升高(5.41±0.91m U/mg protein),8h達(dá)到高峰(9.47±1.22m U/mg protein)較對(duì)照組(4.83±0.62m U/mg protein)顯著增高(P0.05),然后逐漸下降。GSH在加入高糖16h后(7.41±0.92 nmol/mg protein)較對(duì)照組(10.33±1.56nmol/mg protein)顯著下降(P0.05)。而GSSG和GSSG/T-GSH比值隨時(shí)間逐漸增加,2h后開始升高分別為0.78±0.082 nmol/mg protein和6.38±0.72%,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.05),8h后繼續(xù)增加(P0.05),到24h時(shí)GSSG達(dá)到1.23±0.15nmol/mg protein,GSSG/T-GSH為12.1±1.49%(P0.05)。而高糖(35.5 m M)處理晶狀體上皮細(xì)胞24h后,與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡情況不顯著,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax隨時(shí)間表達(dá)上調(diào),Pro-Caspase 3表達(dá)逐漸下降。結(jié)論:1.晶狀體前囊膜TTase表達(dá)與活性在年輕糖尿病患者較年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者增高;TTase活性與糖尿病患者的年齡、病程、糖化血紅蛋白、GSH和GSSG、糖尿病視網(wǎng)膜病變的程度相關(guān),可能在糖尿病性白內(nèi)障的形成中有重要的保護(hù)作用;而不同類型年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成與TTase關(guān)系不明顯[1]。2.腹腔注射STZ可誘導(dǎo)糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯的晶狀體混濁,GSH的含量下降,GSSG增高,同時(shí)TTase的表達(dá)和活性降低,且與晶狀體的混濁程度和GSH、GSSG的變化相關(guān),提示TTase協(xié)同參與糖尿病大鼠白內(nèi)障形成中氧化損傷的機(jī)制。3.高糖處理晶狀體上皮細(xì)胞可誘發(fā)TTase表達(dá)快速上調(diào),并呈濃度依賴性,同時(shí)伴GSH的含量下降,GSSG增加,凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化,提示TTase可能參與細(xì)胞對(duì)高糖刺激的反應(yīng),且與高血糖引起的晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡有關(guān),并可能對(duì)細(xì)胞有一定保護(hù)作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between the content of TTase and the changes of TTase in the lens epithelial cells of diabetic rats . The relationship between the changes of TTase activity and the age , course , vision , blood sugar , glycosylated hemoglobin and GSH were studied . Western blot was used to detect the expression of TTase in the lens of the two groups . The contents of GSH and Gg were measured and calculated by using DTNB method . The relationship between TTase and lens opacity , GSH and Gg was analyzed by SPSS statistical software . Results : 1.TTase activity was similar to that of age group ( 2.64 鹵 0.83 mU / mg protein ) . Results : 1 . The activity of TTase was similar to that of age group ( 2.64 鹵 0.83 mU / mg protein ) . There was no significant difference in TTase activity in the anterior capsule of diabetic rats than that in the control group ( P < 0.01 ) . The results showed that the expression of lens TTase in diabetic rats was significantly lower than that in the control group ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression and activity of TTase increased significantly ( P < 0.05 ) , and the expression and activity of the related protein Bax were significantly higher than those in the control group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R776.1;R587.2

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本文編號(hào)：1880303