發(fā)布時(shí)間：2018-05-02 05:24

  本文選題：鼻咽腫瘤 + BCRF-1��； 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：[背景和目的] 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其起病隱匿、轉(zhuǎn)移早、治療后容易復(fù)發(fā),五年生存率始終在60%以下。鼻咽癌發(fā)病主要與EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染、環(huán)境(主要為化學(xué)致癌物)及遺傳等多種因素相關(guān)。EBV病毒感染是目前公認(rèn)的鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一,其編碼蛋白從致瘤、抑制免疫、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤細(xì)胞調(diào)亡等方面促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。 EB病毒的BCRF-1基因片段編碼vIL-10與人IL-10有83%的同源性,具有和人IL-10類(lèi)似的免疫抑制作用,但缺乏免疫調(diào)節(jié)作用,vIL-10可通過(guò)多種途徑抑制腫瘤免疫應(yīng)答,從而促使腫瘤逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視。在腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中,MHC-Ⅰ類(lèi)分子限制的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在阻止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。腫瘤抗原是內(nèi)源性抗原,首先由低分子量多肽((low molecular weightpolypeptide,LMP)-2、7消化.加工成一定分子量的抗原肽,然后與抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(Transporter association antigen processing,TAP)-1.2結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,MHC(主要是HLA-Ⅰ)結(jié)合抗原肽后將其呈遞至細(xì)胞表面供CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)識(shí)別,從而啟動(dòng)細(xì)胞免疫。由于MHC-Ⅰ類(lèi)基因、TAP基因、LMP基因位置靠近,轉(zhuǎn)錄活性同時(shí)受干擾素的誘導(dǎo),能夠協(xié)調(diào)三者基因產(chǎn)物的量,有效提呈抗原,故三者構(gòu)成的系統(tǒng)被比喻成真核生物MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工和提呈的“操縱子”。在一系列抗原呈遞過(guò)程中,無(wú)論哪個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都會(huì)影響腫瘤抗原的提呈,抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫殺傷。因此,明確鼻咽癌中vIL-10是否對(duì)MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工和提呈的“操縱子”表達(dá)具有影響以及導(dǎo)致這種影響的機(jī)制可以幫助我們更加進(jìn)一步理解鼻咽癌患者的免疫狀態(tài)。 本文主要目的：通過(guò)石蠟切片了解鼻咽癌組織中“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”(即TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ)表達(dá)的變化及其與臨床因素的關(guān)系；通過(guò)研究鼻咽癌組織中BCRF-1mRNA及vIL-10蛋白質(zhì)的表達(dá),明確vIL-10對(duì)鼻咽癌患者免疫細(xì)胞的影響；通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)了解vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”表達(dá)的影響；闡明vIL-10對(duì)NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響以及對(duì)其下游“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”基因表達(dá)的影響。 [方法] 本研究分四部分： 1、鼻咽癌組織“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”表達(dá)的研究 收集昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(云南省腫瘤醫(yī)院)頭頸外科住院患者,病理證實(shí)為鼻咽低分化鱗癌,同期因鼻咽部腫塊至云南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科就診,并行鼻咽部取材病理證實(shí)為鼻咽部非特異性炎癥為對(duì)照組,免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)鼻咽癌石蠟切片中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ的表達(dá),流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)鼻咽癌患者及對(duì)照組外周血中CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)空腹外周靜脈血IL-10含量,并對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2、鼻咽癌組織中BCRF-1基因表達(dá)及其對(duì)免疫功能影響的研究RT-PCR檢測(cè)鼻咽癌組織中BCRF-1mRNA, Western Blot檢測(cè)鼻咽癌組織中vIL-10蛋白質(zhì)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼻咽癌患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞的比例。3、vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”表達(dá)影響的研究 收集不同時(shí)間段vIL-10處理的鼻咽癌細(xì)胞,RT-PCR、Western Bolt方法檢測(cè)vIL-10處理的鼻咽癌細(xì)胞中“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”(即TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-I)表達(dá)的變化。 4、vIL-10通過(guò)NF-κB通路對(duì)“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”基因表達(dá)影響的研究 (1)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-TNFα轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌TNF-α的濃度,不同濃度TNF-a作用鼻咽癌細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)不同時(shí)間段TNF-a對(duì)NF-κB的活性的影響； (2)不同濃度的vIL-10預(yù)處理鼻咽癌細(xì)胞株2小時(shí)后,15ng/mLTNF-α再刺激鼻咽癌細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)NF-κB通路各個(gè)蛋白的變化； (3)免疫熒光方法觀察vIL-10對(duì)NF-κBp65核轉(zhuǎn)位活性的影響； (4) EMS A法檢測(cè)NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合活性； (5)CHIP法檢測(cè)vIL-10對(duì)NF-κB目的基因(即MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工和提 呈“操縱子”)表達(dá)的影響。 [結(jié)果] 1、鼻咽癌組織“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”的低表達(dá)及其與臨床因素的關(guān)系：①TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ在鼻咽癌組織中表達(dá)分別為43.1%、46.55%、41.38%、44.83%、50.00%(25/58、27/58、24/58、26/58、29/58)均低于鼻咽非腫瘤組織中的表達(dá)90.00%、95.00%、95.00%、95.00%、95.00%(18/20、19/20、19/20、19/20、19/20)(P0.05)；②鼻咽癌組CD4+T細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(33.41±10.04%vs40.15±3.56%,P0.05),CD8+T細(xì)胞比例與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(25.32±8.29%vs22.89±2.24%,P0.05),鼻咽癌組IL-10表達(dá)明顯高于對(duì)照組(13.12±1.23vs3.69±1.03ng/ml,P0.05)；③鼻咽癌中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表達(dá)與年齡、性別無(wú)相關(guān)性(P0.05),與TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05)；④CD8+T細(xì)胞與TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表達(dá)成正比,IL-10表達(dá)與TAP-1,TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ表達(dá)成反比,CD4+T細(xì)胞與TAP-1, TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性；⑤Kaplan-Meier分析提示：臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分型、TAP-1表達(dá)、TAP-2表達(dá)、LMP-2表達(dá)、LMP-7表達(dá)、HLA-Ⅰ表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后相關(guān),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。多因素Cox回歸模型分析：有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及HLA-Ⅰ表達(dá)為鼻咽癌患者獨(dú)立預(yù)后因素(P分別為0.041,0.042)。 2、鼻咽癌組織vIL-10的高表達(dá)及其與免疫細(xì)胞的關(guān)系：①34例鼻咽癌組織BCRF-1mRNA呈陽(yáng)性(34/40,85%),16例鼻咽正常組織BCRF-1mRNA呈陽(yáng)性(16/20,80%),兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；②30例鼻咽癌組織vIL-10呈陽(yáng)性(30/40,75%),10例鼻咽正常組織vIL-10呈陽(yáng)性(10/20,50%),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；③40例鼻咽癌患者分為vIL-10陽(yáng)性組和vIL-10陰性組,vIL-10陽(yáng)性組CD4+T細(xì)胞及CD4+T/CD8+T比值明顯低于vIL-10陰性組(24.99±3.88%VS35.92±6.31%,0.86VS1.99,P0.05),vIL-10陽(yáng)性組CD8+T細(xì)胞也明顯低于vIL-10陰性組(20.10±7.68%VS30.61±3.34%,P0.05)。 3、vIL-10抑制鼻咽癌細(xì)胞株“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”的表達(dá)：(1)mRNA水平上：①CNE-1和CNE-2的TAP-1在不同時(shí)間點(diǎn)水平均未表現(xiàn)出顯著差異；②vIL-10作用1h、4h、6h、12h時(shí),CNE-1和CNE-2的TAP-2的mRNA均未出現(xiàn)變化,在24h時(shí),TAP-2出現(xiàn)顯著下降甚至消失；③LMP-2的mRNA在24h時(shí),CNE-1的LMP-2mRNA出現(xiàn)減弱,CNE-2的LMP-2mRNA甚至消失；④CNE-1細(xì)胞在vIL-10作用后1h即出現(xiàn)LMP-7下降,而CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后6h出現(xiàn)下降；⑤在24h時(shí)CNE-1和CNE-2的HLA-I mRNA水平出現(xiàn)顯著下降。(2)蛋白水平上：①CNE-1在vIL-10作用后6h時(shí),TAP-1蛋白水平出現(xiàn)略微下降,12h時(shí)并未延續(xù)該下降趨勢(shì)反而有所上升,24h時(shí)TAP-1蛋白水平出現(xiàn)顯著下降(P0.05),CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后6h、12h時(shí),TAP-1蛋白水平比1h增高,在24h時(shí)蛋白水平顯著下降(P0.05)；②CNE-1和CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后1h、6h、12h、24h,TAP-2蛋白水平逐漸下降(P值均0.05)；③vIL-10作用CNE-1細(xì)胞后,LMP-2蛋白水平在12h時(shí)出現(xiàn)顯著下降。CNE-2細(xì)胞中則表現(xiàn)為隨時(shí)間逐漸下降趨勢(shì)(P值均0.05)；④CNE-1細(xì)胞的LMP-7蛋白在vIL-10作用后12h時(shí)出現(xiàn)顯著下降。CNE-2細(xì)胞中LMP-7蛋白出現(xiàn)隨時(shí)間逐漸下降趨勢(shì)(P值均0.05)；⑤CNE-1和CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后,HLA-Ⅰ出現(xiàn)下降趨勢(shì),但是在CNE-1細(xì)胞中各時(shí)間段變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),CNE-2細(xì)胞在24h出現(xiàn)顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4、vIL-10通過(guò)NF-κB通路對(duì)“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”基因表達(dá)影響：(1)vIL-10抑制NF-κ,B通路的活性：①納米材料介導(dǎo)TNF-α轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分泌TNF-α增加,但是未達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需濃度；②TNF-α作用后,CNE-1,CNE-2細(xì)胞的NF-κB p-p65表達(dá)量均增加,并且并且與TNF-α濃度變化成正比；③CNE-2細(xì)胞的IKKa、IKKβ在TNF-α誘導(dǎo)后表達(dá)增加,而CNE-1細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)此種變化,兩種細(xì)胞的p-IKK a/β在TNF-a誘導(dǎo)后表達(dá)均增加；④CNE-1、CNE-2細(xì)胞的IKB a受到TNF-a刺激后表達(dá)減少,并且與TNF-a濃度成反比,兩種細(xì)胞在TNF-α誘導(dǎo)后p-IKB a表達(dá)均增加；⑤CNE-1、CNE-2細(xì)胞的p-IKK a/β、NF-κB p-p65的表達(dá)與vIL-10濃度呈反比,而IKB蛋白表達(dá)與vIL-10濃度呈正比；⑥vIL-10作用CNE-1,CNE-2細(xì)胞后,胞漿中NF-kB p65核轉(zhuǎn)位活性減弱。⑦vIL-10可以抑制鼻咽癌細(xì)胞中NF-κB的DNA結(jié)合活性,在CNE-2中抑制作用呈劑量依賴(lài)性。(2)vIL-10抑制NF-κB目的基因“MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工提呈操縱子”的表達(dá)：ChIP結(jié)果顯示CNE-2細(xì)胞中vIL-10可以通過(guò)NF-κB抑制TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ基因表達(dá)。 [結(jié)論] 1、鼻咽癌組織中TAP-1, TAP-2,LMP-2, LMP-7及HLA-Ⅰ低表達(dá),且與患者免疫抑制相關(guān),HLA-Ⅰ低表達(dá)預(yù)示鼻咽癌患者不良預(yù)后。 2、鼻咽癌組織中高表達(dá)BCRF-1基因及其蛋白產(chǎn)物vIL-10；vIL-10可以使鼻咽癌患者的免疫細(xì)胞發(fā)生偏移,發(fā)揮免疫抑制。 3、vIL-10可明顯抑制鼻咽癌MHC-Ⅰ類(lèi)分子抗原加工和提呈的“操縱子”的表達(dá),并且呈一定的時(shí)間依賴(lài)性。 4、vIL-10可以抑制NF-κBp65活化、核轉(zhuǎn)位及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB與DNA結(jié)合活性,進(jìn)而抑制NF-κB目的基因TAP-1,TAP-2,LMP-2,LMP-7及HLA-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄激活,降低鼻咽癌抗原提呈能力。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE :

Nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) is one of the most common malignant tumors in South China and South - East Asia . It has been found that EBV infection is one of the most important factors in the pathogenesis and development of nasopharyngeal carcinoma . EBV infection is one of the most important factors in the pathogenesis and development of nasopharyngeal carcinoma . EBV infection is one of the most important factors in the pathogenesis and development of nasopharyngeal carcinoma .

In the course of tumor immune response , MHC - 鈪，

本文編號(hào)：1832533