本文選題：內(nèi)皮祖細胞 + 高糖�。� 參考：《吉林大學》2010年博士論文

【摘要】： 內(nèi)皮祖細胞(EPCs)作為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞,在成體血管內(nèi)皮修復和血管新生過程中發(fā)揮重要作用,糖尿病可以導致外周血EPCs數(shù)量的減少及功能障礙,糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展與EPCs功能紊亂密切相關。糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是最為常見的糖尿病微血管眼部并發(fā)癥,以早期的視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙以及晚期的視網(wǎng)膜新生血管形成為主要病理特征,血管內(nèi)皮功能障礙、微血管損傷是DR的主要病理基礎,而EPCs在生理及病理條件下的視網(wǎng)膜血管損傷修復過程中發(fā)揮重要作用,因此推斷DR的發(fā)生發(fā)展與糖尿病導致的EPCs功能障礙密切相關,但有關EPCs參與DR進展的具體機制尚無明確報道。臨床上,糖尿病的主要標志是血糖的升高,高糖可能是導致糖尿病EPCs功能異常的主要原因,因此探討高糖對EPCs生物學特性的影響及其相關機制,對研究DR等糖尿病血管并發(fā)癥的病因及其防治非常重要。 研究目的 研究體外高糖環(huán)境對EPCs增殖、凋亡、粘附、攝取LDL能力等生物學特性的影響及相關機制,為進一步探討EPCs參與DR發(fā)生發(fā)展的可能機制及調(diào)控途徑奠定基礎,同時為DR等眼內(nèi)新生血管性疾病的治療尋找新的靶點。 研究方法 1.密度梯度離心法分離人臍帶血單個核細胞,體外誘導分化為EPCs并鑒定。 2.高糖及正常條件下培養(yǎng)EPCs,MTT法檢測高糖對細胞增殖能力的影響;流式細胞儀檢測高糖對EPCs凋亡數(shù)量的影響;RT-PCR法檢測高糖對EPCs凋亡相關基因Bcl-2、Bax在mRNA表達水平的影響;共聚焦顯微鏡檢測高糖對EPCs攝取acLDL能力的影響;Fluo3/AM負載EPCs,共聚焦顯微鏡下檢測各組細胞細胞內(nèi)游離鈣離子水平([Ca2+]i),細胞外加入氯化鈣(CaCl2),動態(tài)檢測各組EPCs [Ca2+]i的變化;膜片鉗技術研究EPCs的電生理特性并研究氋糖對EPCs電生理特性的影響;Western-blot檢測體外高糖環(huán)境對EPCs內(nèi)p-eNOS以及p-AKT蛋白表達的影響。 3.光動力法建立大鼠視網(wǎng)膜血管損傷模型,眼底照相及熒光眼底造影判定視網(wǎng)膜血管損傷情況,RT-PCR法檢測視網(wǎng)膜血管損傷后視網(wǎng)膜SDF-1 mRNA表達水平的變化。 結果 1.臍帶血單個核細胞經(jīng)體外誘導分化,3d內(nèi)可形成小集落,10d左右增殖旺盛,可見紡錘形細胞,于2-3w時呈現(xiàn)EPCs典型的鋪路石樣外觀。流式細胞學結果顯示EPCs體外培養(yǎng)10d時CD133、CD34、VEGFR2、CD31均有一定程度的表達,大部分細胞DiI-acLDL、FITC-UEA-I雙染色陽性。免疫細胞化學染色結果顯示EPCs內(nèi)有VEGF的陽性表達。 2.①氋糖培養(yǎng)1d時EPCs增殖活力較正常對照組增強( P0.05),3d時與正常對照組比較無明顯差異,氋糖培養(yǎng)7d時EPCs增殖活力較正常對照組降低( P0.05);②氋糖培養(yǎng)1d及3d時,EPCs粘附能力與正常對照組比較均明顯降低( P0.05);③高糖培養(yǎng)7d,與正常對照組比較,EPCs凋亡細胞數(shù)增加,Bax mRNA表達上調(diào),而Bcl-2 mRNA表達降低。④高糖培養(yǎng)3d時EPCs[Ca2+ ]i水平較正常對照組無顯著差別;在無鈣介質(zhì)中,各組EPCs在加入氯化鈣(CaCl2)后均出現(xiàn)快速大幅度的[Ca2+]i升高,高糖組[Ca2+]i升高的幅度較正常對照組小;兩組細胞[Ca2+]i在快速升高后迅速下降,正常組EPCs的[Ca2+]i均恢復至靜息水平,而高糖組部分EPCs的[Ca2+]i未能恢復至靜息水平。⑤正常條件下EPCs的靜息膜電位維持在-50mv左右,在TEA作用下膜電流幅度降低,表明存在鈣依賴性鉀電流參與膜電位的構成。氋糖培養(yǎng)下EPCs靜息膜電位水平及膜電流幅度無明顯差別。⑥Western-blot結果顯示高糖培養(yǎng)7d,eNOS及AKT的磷酸化水平較正常組比較均明顯降低(P0.05)。3.光動力法光凝視網(wǎng)膜靜脈可以造成大鼠視網(wǎng)膜血管損傷,出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管閉塞、滲漏、視網(wǎng)膜出血等眼底表現(xiàn),視網(wǎng)膜血管損傷后3d及14d時,視網(wǎng)膜組織SDF-1 mRNA表達水平較正常組增高。 結論 1.高糖可能通過抑制PI3K/AKT/eNOS通路影響EPCs的增殖、粘附、動員等生物學功能,并可能通過在mRNA水平上調(diào)Bax表達并抑制Bcl-2表達而促進EPCs凋亡。2.高糖可以影響EPCs鈣穩(wěn)態(tài),使細胞易于發(fā)生鈣超載,高糖導致的EPCs功能紊亂可能與鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)導致的細胞內(nèi)鈣信號通路異常有關。3.EPCs細胞膜表面存在鈣依賴性鉀通道(KCa),KCa參與了EPCs膜電位的維持。高糖對EPCs膜電位水平及膜電流幅度無顯著影響。4.視網(wǎng)膜血管損傷可導致視網(wǎng)膜局部SDF-1水平的增高,SDF-1/CXCR4軸可能在EPCs參與視網(wǎng)膜血管損傷修復及新生血管的形成過程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Endothelial progenitor cells ( EPCs ) , as precursor cells of vascular endothelial cells , play an important role in vascular endothelial repair and angiogenesis . Diabetic retinopathy ( DR ) is the most common complication of diabetic microvessels .



Purpose of study



The effects of high glucose environment in vitro on the proliferation , apoptosis , adhesion and LDL - uptake of EPCs were studied .



Research Methods



1.separating human umbilical cord blood mononuclear cells from human umbilical cord blood by density gradient centrifugation , inducing differentiation into EPCs in vitro and identifying .



2 . The effects of high glucose on the proliferation of EPCs were detected by MTT assay . The effects of high glucose on the apoptosis of EPCs were detected by flow cytometry . The effects of high glucose on the expression of EPCs were detected by RT - PCR . The electrophysiological properties of EPCs were detected by confocal microscopy . The effects of high glucose environment on the electrophysiological properties of EPCs were studied . Western - blot was used to detect the effects of high glucose environment on the expression of p - eNOS and p - protein in EPCs .



3 . The retinal vessel injury model , fundus photography and fundus fluorescein angiography were established to determine retinal vessel injury . RT - PCR was used to detect the level of retinal SDF - 1 mRNA expression after retinal vascular injury .



Results



The results of flow cytometry showed that CD133 , CD34 , VEGFR2 and CD31 had a certain degree of expression . The results of flow cytometry showed that CD133 , CD34 , VEGFR2 and CD31 had a certain degree of expression . Most of them were positive for DiI - acLDL and FITC - UEA - I .



There was no significant difference between EPCs and normal controls ( P0.05 ) .



Conclusion



1 . High glucose could inhibit the proliferation , adhesion , mobilization and other biological functions of EPCs by inhibiting the expression of Bax and inhibiting the expression of Bcl - 2 in EPCs .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R774.1

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 石慧;內(nèi)皮祖細胞眼內(nèi)移植的示蹤及對視網(wǎng)膜血管損傷修復的研究[D];吉林大學;2011年

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本文編號：1828262