本文選題：Usher綜合征 + Stargardt病��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的： 遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病(Hereditary retinal dystrophies, HRD)一般由基因缺陷引起，是一類進(jìn)行性的、不可逆的致盲性眼病，嚴(yán)重威脅人類的視覺健康。Usher綜合征(UsherSyndrome,USH)和Stargardt病(Stargardt disease, STGD)是其中兩類嚴(yán)重危害青少年視功能的先天性視網(wǎng)膜變性疾病，具有復(fù)雜的臨床表型和高度的遺傳異質(zhì)性。USH是遺傳性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)綜合征型里最常見的類型，其中Ⅰ型患者出生即發(fā)��；STGD是青少年最常見的中心視功能受損的黃斑營養(yǎng)不良疾病。針對這類遺傳性視網(wǎng)膜疾病，研究其致病基因和突變譜，不但可以在優(yōu)生優(yōu)育上進(jìn)行預(yù)測和指導(dǎo)，提早預(yù)防，早期診斷，還可以從分子水平掌握其發(fā)病機(jī)制，對病變的組織、細(xì)胞和基因進(jìn)行靶向的基因或細(xì)胞治療。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因診斷技術(shù)已從篩選單個(gè)候選基因發(fā)展到基因芯片到高通量的第二代測序技術(shù)(Next generationsquencing, NGS)，使得致病突變的檢測更為簡便、高效和準(zhǔn)確，推動基因治療走向臨床。本課題將目標(biāo)序列捕獲芯片和NGS技術(shù)相結(jié)合，對五個(gè)USH家系和五個(gè)STGD家系進(jìn)行致病基因的檢測和驗(yàn)證，并詳細(xì)分析了臨床表型、探討了臨床表型和基因突變型的關(guān)聯(lián)。 方法： 1、對HRD相關(guān)信息采集、整理和保存流程進(jìn)行規(guī)范化，并對眼科�？茩z查的流程標(biāo)準(zhǔn)化。遺傳信息包括知情同意書和基本信息調(diào)查表的填寫，家系系譜的繪制、抽取外周靜脈血進(jìn)行保存或制備基因組DNA。建立完整規(guī)范的遺傳資源數(shù)據(jù)庫，包括紙質(zhì)檔案管理系統(tǒng)和電子檔案管理系統(tǒng)。 2、根據(jù)USH和STGD的遺傳學(xué)特征，改良設(shè)計(jì)完成以103個(gè)已知的HRD相關(guān)致病基因（涵蓋了12個(gè)USH的致病基因，和5個(gè)STGD的致病基因）為目標(biāo)序列的捕獲芯片，運(yùn)用NGS技術(shù)，建立HRD的臨床分子遺傳學(xué)診斷平臺。 3、收集USH家系患者的詳細(xì)病史，，完善眼科的�？茩z查包括最佳矯正視力（BestCorrected Visual Acuity, BCVA）、閃光視網(wǎng)膜電圖（Flash Electroretinogram，F(xiàn)ERG）、眼底彩照、眼底自發(fā)熒光（Autofluorescence，AF）和黃斑區(qū)的光學(xué)相干斷層掃描（OpticalCoherence Tomograpy, OCT），完成了臨床聽力學(xué)檢測和前庭功能的檢查，總結(jié)分析五個(gè)USH家系的臨床特征。 4、運(yùn)用特定基因的目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)對五個(gè)USH先證者進(jìn)行測序，對測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，檢測篩選出致病基因突變，并進(jìn)一步通過多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴(kuò)增和直接Sanger測序驗(yàn)證，家系中基因型和疾病表型的共分離驗(yàn)證，以及基因突變的致病性預(yù)測，確定五個(gè)USH家系的致病基因突變。 5、采集STGD家系患者的病史，完整眼科專科檢查包括BCVA、FERG、圖形視網(wǎng)膜電流圖(Pattern Electroretinogram, PERG)、多焦視網(wǎng)膜電圖（multifocalelectroretinogram, mfERG）、眼底彩照和眼底熒光血管造影（Fundus FluoresceinAngiography，F(xiàn)FA）、AF和黃斑OCT檢查，分析五個(gè)STGD家系的臨床表型。 6、運(yùn)用前述的目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)，通過Sanger測序驗(yàn)證，家系中基因型和疾病表型的共分離驗(yàn)證，和基因突變的致病性預(yù)測，確定五個(gè)STGD家系的致病基因突變。 結(jié)果： 1、建立了科學(xué)、規(guī)范、合理的HRD家系遺傳資源收集保存的操作規(guī)程和眼科功能學(xué)影像學(xué)的檢查流程，使遺傳信息收集和眼科檢查標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化。 2、改良設(shè)計(jì)完成以103個(gè)HRD相關(guān)致病基因?yàn)槟繕?biāo)序列的外顯子捕獲芯片，以遺傳學(xué)研究領(lǐng)域先進(jìn)的NGS為技術(shù)手段，建立了包括對散發(fā)型RP或綜合征型RP（USH）及STGD等HRD的臨床分子遺傳學(xué)診斷平臺。 3、五個(gè)USH家系的患者表現(xiàn)出典型的RP癥狀，USH-Family1和USH-Family2患者出生即發(fā)病，伴有特征性的運(yùn)動發(fā)育遲緩和聾啞癥狀，臨床診斷為USH1。其余三個(gè)家系患者發(fā)病多于青春期后，中度或重度的感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearingloss, SNHL)，前庭功能正常，臨床診斷為USH2。 3、完成五個(gè)USH家系的分子遺傳學(xué)研究，檢測并證實(shí)了10個(gè)USH基因的致病突變，其中6個(gè)突變?yōu)楸狙芯渴状螆?bào)道：基因MYO7A的無義突變c.4398GA (p.Trp1466Ter)和第38-48號外顯子大片段的雜合缺失突變(EX38-49del)；基因USH1C純合缺失突變c.988_989delAT (p.Ile330ProfsX24)；基因USH2A的缺失突變c.15104_15105delCA,(p.Thr5035ArgfsX142)和插入突變c.6875_6876insG (p.Arg2292ArgfsX39)。 6、五個(gè)STGD家系的患者表現(xiàn)出多樣的臨床特征。STGD-Family1（AF呈現(xiàn)Ⅰ型）和STGD-Family4（AF呈現(xiàn)Ⅱ型）中心視力下降出現(xiàn)的年齡晚（20歲），電生理為1型，表型輕度。STGD-Family2、STGD-Family3和STGD-Family5家系，患者中心視力下降年齡早（6、7歲和3歲），AF呈現(xiàn)Ⅱ或Ⅲ型，電生理為3型，表型嚴(yán)重。異常AF的區(qū)域和OCT中IS/OS中斷消失的區(qū)域一致。 7、完成五個(gè)STGD家系的分子遺傳學(xué)研究，檢測并鑒定了基因ABCA49個(gè)致病突變，已報(bào)道過的無義突變c.6118CT (p.Arg2040Ter)出現(xiàn)在兩個(gè)家系中，6個(gè)突變?yōu)楸狙芯渴状伟l(fā)現(xiàn)：錯(cuò)義突變c.6190GA (p.Ala2064Thr)；剪接突變c.1937+1GA和c.1761-2AG；無義突變c.2424CG (p.Tyr808Ter)；缺失突變c.371delG(p.Arg124LeufsX30)；37號外顯子大片段的雜合缺失突變EX37del。 結(jié)論： 1、HRD標(biāo)準(zhǔn)化遺傳資源數(shù)據(jù)庫的建立，確保了本研究的規(guī)范性和統(tǒng)一性，保障了遺傳資源采集工作的延續(xù)，為臨床的分子遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 2、改良設(shè)計(jì)完成的目標(biāo)序列捕獲芯片，結(jié)合先進(jìn)的高通量NGS技術(shù)，能準(zhǔn)確、高效的完成USH和STGD等HRD的臨床分子遺傳學(xué)診斷，提高致病基因的檢出率。 3、USH和STGD的致病基因檢測，拓展了中國人群這兩類疾病的突變頻譜，和臨床表型相結(jié)合分析，能幫助早期診斷、鑒別診斷，評估病情分級和預(yù)后，指導(dǎo)婚育。 4、視覺電生理包括FERG、PERG和mfERG，聯(lián)合眼底AF、黃斑OCT是STGD診斷和病情分級重要的檢查手段，特征性改變能同步揭示視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的損害程度。 5、對于USH和STGD，基因型和臨床表型密切相關(guān)。雙等位基因突變均為截?cái)嘈突蚪財(cái)嘈吐?lián)合外顯子大片段的雜合缺失突變，臨床表型嚴(yán)重。
[Abstract]:Research background and purpose:
Genetic retinal degeneration (Hereditary retinal dystrophies, HRD), which is usually caused by genetic defects, is a progressive, irreversible blinding eye disease, which is a serious threat to human visual health.Usher syndrome (UsherSyndrome, USH) and Stargardt disease (Stargardt disease, STGD), which are the two types of serious harm to adolescent visual function. Congenital retinal degeneration, with complex clinical phenotypes and high genetic heterogeneity.USH is the most common type of hereditary retinitis pigmentosa (RP) syndrome, of which type I patients are born at birth; STGD is the most common macular malnutrition disease that is most common in the central visual function of adolescents. In view of this type of genetic retinal disease, the study of its pathogenic gene and mutation spectrum can not only predict and guide eugenics, early prevention, early diagnosis, but also can master its pathogenesis from molecular level, targeted gene or cell therapy for the tissues, cells and genes of the disease. With the development of molecular biology technology Rapid development, gene diagnosis technology has developed from single candidate gene to gene chip to high flux second generation sequencing technology (Next generationsquencing, NGS), making the detection of pathogenic mutation more convenient, efficient and accurate, promoting gene therapy to clinical. This lesson combines target sequence capture chip and NGS technology, to five USH family and five STGD families were used to detect and verify the pathogenic genes. The clinical phenotype was analyzed in detail, and the correlation between clinical phenotype and gene mutation was discussed.
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本文編號：1826615