本文選題：Waardenburg綜合征 + 小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子��； 參考：《聽力學(xué)及言語疾病雜志》2014年04期

【摘要】：目的通過體外實(shí)驗(yàn)研究小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)突變基因功能,初步探討其致Ⅱ型Waardenburg綜合征(Waardenburg syndrome,WS)發(fā)病的分子機(jī)制。方法以野生型MITF基因真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pCMV-MITF-Flag為模板分別構(gòu)建二個(gè)致Ⅱ型WS的MITF基因新發(fā)突變R217I和T192fsX18的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。野生MITF和突變R217I和T192fsX18表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞),應(yīng)用Western blot和細(xì)胞免疫熒光分別檢測其表達(dá)和亞細(xì)胞定位;應(yīng)用熒光素酶活性檢測系統(tǒng)通過對(duì)酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)報(bào)告基因活性檢測觀察野生/突變MITF蛋白對(duì)其靶基因TYR轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用,以及二個(gè)突變蛋白對(duì)野生MITF蛋白功能的影響;應(yīng)用生物素標(biāo)記的含E box基序(CATGTG)的DNA寡核苷酸鏈探針分別沉淀MITF、R217I及T192fsX18蛋白,檢測野生/突變MITF蛋白與靶基因TYR啟動(dòng)子的結(jié)合力。結(jié)果成功構(gòu)建了突變型R217I、T192fsX18真核細(xì)胞重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fsX18-Flag,MITF蛋白與R217I、T192fsX18突變蛋白在黑色素瘤細(xì)胞中正確表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。突變R217I蛋白與野生MITF蛋白一樣僅在細(xì)胞核中分布,而T192fsX18蛋白則出現(xiàn)異常亞細(xì)胞定位,僅在細(xì)胞質(zhì)中分布。盡管R217I蛋白仍殘余部分功能可增加TYR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,但與野生MITF蛋白相比,二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而T192fsX18蛋白則完全失去調(diào)控TYR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性作用(P0.01);二者均未對(duì)野生MITF蛋白功能產(chǎn)生顯性負(fù)效應(yīng)(P0.05)。突變R217I蛋白與野生MITF蛋白均可與TYR啟動(dòng)子特異DNA序列E-box結(jié)合,而突變T192fs X18蛋白則不能與之結(jié)合。結(jié)論 R217I和T192fsX18突變蛋白通過影響靶基因TYR轉(zhuǎn)錄活性,使其表達(dá)下調(diào)、黑色素合成減少,以單倍體劑量不足效應(yīng)致Ⅱ型WS。
[Abstract]:Objective to investigate the molecular mechanism of the pathogenesis of Waardenburg syndrome (WS) induced by Waardenburg syndrome (Waardenburg syndrome, WS) by studying the function of microphthalmia-associated transcription factor (MITF) mutation gene in vitro. Methods the expression plasmid pCMV-MITF-Flag of the wild type MITF eukaryotic expression plasmid was used as a model. Two new MITF gene mutation R217I and T192fsX18 eukaryotic expression plasmids were constructed respectively. Wild MITF and mutant R217I and T192fsX18 expressed plasmids transiently transfected melanoma cells or mouse embryonic fibroblasts (NIH3T3 cells). Western blot and cell immunofluorescence were used to detect their expression and subcells respectively. Localization; using the luciferase activity detection system to detect the transcriptional activity of the wild / mutant MITF protein on its target gene TYR through the detection of tyrosinase (tyrosinase, TYR) gene activity, and the effect of the two mutant proteins on the function of the wild MITF protein, and the DNA oligoside containing the E box motif (CATGTG) labeled with biotin The acid chain probes precipitated MITF, R217I and T192fsX18 proteins to detect the binding force between the wild / mutant MITF protein and the target gene TYR promoter. The mutant R217I, the T192fsX18 eukaryotic recombinant expression plasmid pCMV-R217I-Flag and pCMV-T192fsX18-Flag, MITF protein and R217I, and the T192fsX18 mutant protein in the melanoma cells were successfully constructed. It was confirmed that the recombinant plasmid was correct in the construction of the recombinant plasmid. The mutant R217I protein was only distributed in the nucleus as in the wild MITF protein, while the T192fsX18 protein appeared abnormal subcellular localization and only in the cytoplasm. Although the residual function of the R217I protein could increase the transcriptional activity of the TYR promoter, it was associated with the wild MITF protein. The differences of the two were statistically significant (P0.01), while T192fsX18 protein completely lost the transcriptional activity of TYR promoter (P0.01); the two had no dominant negative effect on the function of wild MITF protein (P0.05). The mutant R217I protein and the wild MITF protein could be combined with the TYR promoter specific DNA sequence, and the mutant T192fs eggs were mutated. White can not be combined with it. Conclusion R217I and T192fsX18 mutant proteins can reduce the expression of TYR by affecting the transcriptional activity of the target gene, decrease the synthesis of melanin, and cause the type II WS. by the effect of the haploid dose deficiency.

【作者單位】： 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科;中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉科;中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81260160,81170923)資助
【分類號(hào)】：R764.43

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本文編號(hào)：1804200