本文選題：鼻咽癌 + EBV-LMP1　； 參考：《鄭州大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：表觀遺傳(epigenetics)是指DNA序列沒有發(fā)生變化,但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變,這種改變反映的是環(huán)境因素和遺傳因素的相互作用。與人類多數(shù)疾病一樣,腫瘤發(fā)生也有其自身的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。DNA甲基化水平紊亂和組蛋白修飾異常是人類腫瘤最常見的表觀遺傳學(xué)改變。組蛋白在翻譯完成后,其N-末端氨基酸殘基發(fā)生乙�；�、磷酸化、甲基化和泛素化等共價(jià)修飾,引起染色體結(jié)構(gòu)的改變,進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。近年來,在人類多數(shù)腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有組蛋白修飾酶和組蛋白修飾的異常。 組蛋白H3磷酸化是組蛋白修飾的重要方式之一,其中第10位絲氨酸(Ser10)磷酸化與有絲分裂染色體濃縮、細(xì)胞周期以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān),在腫瘤研究領(lǐng)域中具有重要意義。已報(bào)道多種腫瘤促進(jìn)因子如表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)、UVB和砷等以及原癌基因H-ras、v-Src均可誘導(dǎo)組蛋白H3Ser10磷酸化,與即刻早期(immediate-early, IE)基因c-fos、c-jun、c-myc以及Cox-2等轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。在人類多種腫瘤組織中包括直腸癌、肝癌、宮頸癌和胃癌等均發(fā)現(xiàn)有組蛋白H3SerlO磷酸化水平的增高,并且與腫瘤惡性程度相關(guān)。這些研究表明組蛋白H3SerlO磷酸化異�？赡苁钦{(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要表觀遺傳學(xué)改變。 大量研究證實(shí)各種體外刺激因素誘導(dǎo)的組蛋白H3SerlO磷酸化涉及多條不同的蛋白激酶信號(hào)通路,與特異性刺激/應(yīng)激及細(xì)胞類型有關(guān)。近年來,各種蛋白激酶包括MSK1(mitogen-and stress-activated kinase1)、RSK2(ribosomal protein S6kinase2)、IKK-α (IkappaB kinase-alpha)、PKC (cAMP dependent protein kinase C)、Fyn及PIM1等相繼被發(fā)現(xiàn)要參與調(diào)控不同刺激作用下組蛋白H3Ser10磷酸化,誘導(dǎo)特異性基因轉(zhuǎn)錄。在原癌基因H-ras、v-Src以及EGF、TPA誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中,MSK1活化對(duì)于組蛋白H3SerlO磷酸化以及激活蛋白-1(activating protein-1, AP-1)轉(zhuǎn)錄激活是必需的。因此,明確特異性刺激作用下調(diào)控組蛋白H3磷酸化的蛋白激酶及其信號(hào)通路對(duì)闡明組蛋白H3磷酸化的作用具有重要意義。 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是高發(fā)于我國南方和東南亞地區(qū)的一種頭頸部惡性腫瘤。流行病學(xué)調(diào)查顯示,鼻咽癌的病因主要與Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus, EBV)、遺傳因素及環(huán)境因素有關(guān),EB病毒與環(huán)境危險(xiǎn)因素及宿主易感遺傳背景交互作用,促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。鼻咽癌發(fā)病的獨(dú)特病因體系提示：鼻咽癌是研究腫瘤表觀遺傳修飾的最佳模型之一。潛伏性膜蛋白1(latent membrane protein1, LMP1)是目前唯一證實(shí)具有轉(zhuǎn)化功能的EBV基因編碼瘤蛋白,與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LMP1的轉(zhuǎn)化作用在于它能異常激活A(yù)P-1、NF-κB、JAK/STAT信號(hào)通路和多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控靶基因表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、侵襲與轉(zhuǎn)移。組蛋白H3Ser10磷酸化作為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制,是否介導(dǎo)了LMP1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子活化和鼻咽細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,值得我們進(jìn)一步探討。 本課題以組蛋白H3Ser10磷酸化為切入點(diǎn),從組織、細(xì)胞、分子水平研究組蛋白H3Ser10磷酸化在鼻咽癌變,尤其是在EBV-LMP1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞惡性表型中的作用,并進(jìn)一步探討調(diào)控組蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶及信號(hào)通路,將有助于從表觀遺傳學(xué)角度揭示LMP1的致瘤機(jī)制和鼻咽癌的發(fā)生機(jī)制,為組蛋白H3Ser10磷酸化作為鼻咽癌診斷、治療的新靶標(biāo)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分組蛋白H3Ser10磷酸化在LMP1誘導(dǎo)鼻咽癌變中的作用 第一章Ser10磷酸化組蛋白H3在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其與LMP1表達(dá)的相關(guān)性 方法 1.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織以及癌旁/正常組織中組蛋白H3Ser10磷酸化水平。 2.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)EBV-LMP1在鼻咽癌組織的表達(dá),并分析與組蛋白H3Ser10磷酸化水平的相關(guān)性。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blotting檢測(cè)低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE2、高分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE1以及永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69中組蛋白H3Ser10磷酸化水平。 結(jié)果 1.鼻咽癌組織中存在組蛋白H3Ser10磷酸化水平增高 組蛋白H3Ser10磷酸化在48例鼻咽癌組織、15例鼻咽炎癥組織和36例癌旁/正常鼻咽組織的陽性標(biāo)記指數(shù)(positive labeling index, PLI)分別為22.43±10.57、14.87±6.04和8.10±4.78,顯示鼻咽癌組織中組蛋白H3Ser10磷酸化水平要明顯高于慢性鼻咽炎癥組織(P0.05)和癌旁/正常鼻咽組織(P0.001)。慢性鼻咽炎癥組織中H3Ser10磷酸化水平也要明顯高于癌旁/正常鼻咽組織(P0.005)。 2.鼻咽癌組織中LMP1的表達(dá)與組蛋白H3Ser10磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系 在48例鼻咽癌組織中,LMP1陽性表達(dá)為28例(58.3%,28/48)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,LMP1的表達(dá)與組蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌組織中呈正相關(guān)關(guān)系(χ2=6.700,P=0.01；C=0.350)。 3.鼻咽癌細(xì)胞中存在組蛋白H3Ser10磷酸化水平增高 免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blotting結(jié)果顯示,與永生化鼻咽上皮細(xì)胞系NP69相比,組蛋白H3Ser10磷酸化水平在鼻咽癌細(xì)胞中明顯增高,其中以CNE2細(xì)胞表達(dá)水平最高。 第二章EBV-LMP1誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化 方法 1.免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blotting檢測(cè)CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平。 2. Western blotting檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1基因引起CNE1細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平的改變。 3.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染LMP1基因引起CNE1細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄活性的改變。 結(jié)果 1.LMP1誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平增高 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在血清饑餓條件下,組蛋白H3Ser10磷酸化的陽性細(xì)胞數(shù)在穩(wěn)定表達(dá)LMP1的CNE1GL細(xì)胞中要明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CNE1G細(xì)胞,主要為有絲分裂間期細(xì)胞。Western blotting結(jié)果也顯示CNE1GL細(xì)胞中組蛋白H3Ser10磷酸化水平明顯高于CNE1G細(xì)胞。此外,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1基因亦可引起CNE1細(xì)胞組蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高,呈劑量依賴關(guān)系。 2.LMP1誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄激活 雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,轉(zhuǎn)染LMP1基因可促進(jìn)CNE1細(xì)胞中AP-1轉(zhuǎn)錄活性增高,呈劑量依賴關(guān)系。 第三章基因沉默組蛋白H3對(duì)LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響 方法 1.構(gòu)建針對(duì)組蛋白H3基因和無關(guān)序列的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒,與pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞,經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定沉默組蛋白H3基因的CNE1細(xì)胞株及陰性對(duì)照細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)組蛋白H3基因沉默效果。 2.采用CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因沉默組蛋白H3對(duì)LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響。 3.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)基因沉默組蛋白H3對(duì)LMP1誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄激活的影響。 結(jié)果 1.穩(wěn)定干擾組蛋白H3基因表達(dá)的CNE1細(xì)胞株的建立 經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)組蛋白H3基因沉默效果,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照及陰性對(duì)照細(xì)胞相比,siRNA-H3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞中組蛋白H3的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)60%-70%。 2.基因沉默組蛋白H3抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力 與以往的報(bào)道相一致,轉(zhuǎn)染LMP1基因可促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖及克隆形成；但采用siRNA干擾組蛋白H3表達(dá)則可明顯抑制LMP1促進(jìn)的細(xì)胞增殖及克隆形成能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,基因沉默組蛋白H3的CNE1細(xì)胞在培養(yǎng)48h后生長速度明顯減慢；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,其克隆形成數(shù)量和克隆形成大小均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。 3.基因沉默組蛋白H3抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活 雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,干擾組蛋白H3基因表達(dá)可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,其轉(zhuǎn)錄活性下降62.49%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。 第四章過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3對(duì)LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響 方法 1.將人組蛋白H3基因的cDNA重組于pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒以構(gòu)建組蛋白H3野生型真核表達(dá)質(zhì)粒(H3WT),并以此為模板,通過反向PCR法對(duì)組蛋白H3基因第31位堿基進(jìn)行T→G的定點(diǎn)突變,獲得組蛋白H3突變型真核表達(dá)質(zhì)粒(H3S10A)。 2.將野生型和突變型組蛋白H3表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CNE1細(xì)胞,殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株,Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。 3.采用CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3對(duì)LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響。 4. Western blotting和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3對(duì)LMP1誘導(dǎo)的c-Jun、c-Fos蛋白表達(dá)以及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。 結(jié)果 1.穩(wěn)定過表達(dá)野生型和突變型組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株的建立 經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,Western blotting結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染組蛋白H3野生型(H3WT)和突變型(H3S10A)質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞中均可檢測(cè)到標(biāo)簽(His)融合蛋白的表達(dá),表明已成功構(gòu)建過表達(dá)組蛋白H3的CNE1細(xì)胞株。 2.過表達(dá)野生型組蛋白H3促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞相比,過表達(dá)野生型組蛋白H3可促進(jìn)CNE1細(xì)胞的增殖,細(xì)胞在培養(yǎng)72h后生長速度明顯增快；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)野生型組蛋白H3可促進(jìn)低血清條件下CNE1細(xì)胞克隆形成能力。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞相比,過表達(dá)野生型組蛋白H3可增強(qiáng)LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞錨定非依賴性生長能力,其克隆形成率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；但過表達(dá)突變型組蛋白H3并沒有引起明顯改變。 3.過表達(dá)野生型組蛋白H3增強(qiáng)LMP1誘導(dǎo)的c-Jun、c-Fos蛋白表達(dá)及AP-1轉(zhuǎn)錄活性 Western blotting結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞相比,過表達(dá)野生型組蛋白H3可增強(qiáng)LMP1誘導(dǎo)下c-Jun和c-Fos的蛋白表達(dá)水平；但過表達(dá)突變型組蛋白H3并沒有引起明冠改變。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,過表達(dá)野生型,而不是突變型組蛋白H3,可增強(qiáng)LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 第二部分調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化的蛋白激酶信號(hào)通路 第一章蛋白激酶MSK1調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化 方法 1.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Thr581磷酸化MSK1在鼻咽癌組織及癌旁/正常組織中的表達(dá),并分析與LMP1及Ser10磷酸化組蛋白H3在鼻咽癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。 2. Western blotting檢測(cè)CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平,以及轉(zhuǎn)染LMP1基因引起CNE1細(xì)胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平的改變。 3.體外激酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中組蛋白H3激酶活性,以及MSK1抑制劑H89預(yù)處理后組蛋白H3激酶活性的改變。 4.采用p-MSK1抗體免疫沉淀MSK1激酶,體外激酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE1G和CNE1GL細(xì)胞中MSK1激酶活性。 5.ERK1/2抑制劑PD98059和MSK1抑制劑H89處理細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)CNE1細(xì)胞中LMP1誘導(dǎo)組蛋白H3Ser10磷酸化水平的改變。 6.構(gòu)建針對(duì)MSK1基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒,與pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞,殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定沉默MSK1基因的CNE1細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)MSK1基因沉默效果。 7. Western blotting檢測(cè)干擾MSK1基因表達(dá)對(duì)LMP1誘導(dǎo)組蛋白H3Ser10磷酸化水平的影響。 結(jié)果 1.鼻咽癌組織中存在MSK1Thr581磷酸化水平增高 48例鼻咽癌組織和36例癌旁/正常鼻咽組織的免疫組化結(jié)果顯示,MSK1Thr581磷酸化水平在鼻咽癌組織中要明顯高于癌旁/正常鼻咽組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 2.鼻咽癌組織中LMP1的表達(dá)與MSK1Thr581磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系 在48例鼻咽癌組織中,相關(guān)性分析結(jié)果顯示,LMP1的表達(dá)與MSK1Thr581磷酸化水平呈正相關(guān)關(guān)系(χ2=9.600,P=0.002；C=0.408)；并且MSK1磷酸化水平與組蛋白H3Ser10磷酸化水平亦呈正相關(guān)關(guān)系(χ2=11.959,P=0.001；C=0.447)。 3.LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞中MSK1Thr581磷酸化水平的增高 Western blotting結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)LMP1的CNE1GL細(xì)胞中ERK1/2和MSK1磷酸化水平明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CNE1G細(xì)胞。此外,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1基因也可促進(jìn)CNE1細(xì)胞中ERK1/2及MSK1磷酸化水平的增高,呈劑量依賴關(guān)系。 4.LMP1增強(qiáng)CNE1細(xì)胞中組蛋白H3激酶活性 體外激酶活性分析顯示,與CNE1G細(xì)胞相比,CNE1GL細(xì)胞蛋白提取液中組蛋白H3激酶活性明顯增高,但給予MSK1抑制劑H89預(yù)處理后,兩種細(xì)胞的組蛋白H3激酶活性均出現(xiàn)降低。 5.LMP1增強(qiáng)CNE1細(xì)胞中MSKl激酶活性 采用p-MSK1抗體免疫沉淀MSK1蛋白,Western blotting結(jié)果顯示,p-MSK1抗體能有效地將蛋白提取液中MSK1激酶下拉。體外激酶活性分析顯示,與CNE1G細(xì)胞相比,來自CNE1GL細(xì)胞的免疫沉淀復(fù)合物的MSK1激酶活性明顯增強(qiáng)。 6.PD98059和H89抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化 Western blotting結(jié)果顯示,較低濃度的PD98059(10μmol/L)和H89(5μmol/L)即能明顯降低LMP1誘導(dǎo)的H3Ser10磷酸化水平,呈劑量依賴關(guān)系。 7.穩(wěn)定干擾MSKl基因表達(dá)的CNE1細(xì)胞株的建立 經(jīng)殺稻瘟霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)MSK1基因沉默效果,結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,siRNA-MSK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞中MSK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)70%-80%。 8.基因沉默MSK1抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化 Western blotting結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,采用siRNA干擾MSK1基因表達(dá)可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化。 第二章蛋白激酶MSK1在LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中的作用 方法 1.采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H89或基因沉默MSK1對(duì)LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響。 2.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)H89或基因沉默MSK1對(duì)LMP1誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄激活的影響。 結(jié)果 1.H89或基因沉默MSKl抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,干擾MSK1基因表達(dá)可抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞增殖,細(xì)胞在培養(yǎng)48h后生長速度明顯減慢；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布,結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,干擾MSK1基因表達(dá)可引起Go/G1期細(xì)胞比例增加(P0.001),而S期細(xì)胞比例減少(P0.001),提示阻滯細(xì)胞周期G1/S進(jìn)程可能是下調(diào)MSK1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖的重要原因。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,H89或基因沉默MSK1表達(dá)均可明顯抑制LMP1促進(jìn)的CNE1細(xì)胞克隆形成能力,其克隆形成數(shù)量和克隆形成大小均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。 2.H89或基因沉默MSKl抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活 雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,與未處理組細(xì)胞相比,5μmol/L H89即可明顯降低LMP1誘導(dǎo)的AP-1活性,呈劑量依賴關(guān)系；同樣,采用siRNA干擾MSK1基因表達(dá)亦可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,其轉(zhuǎn)錄活性下降57.21%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。 第三章TAK1通過激活p38/MSK1通路參與調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化 方法 1.采用TAK1抗體免疫沉淀TAK1激酶,以MKK6重組蛋白為底物,體外激酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LMP1誘導(dǎo)TAK1激酶活性的改變。 2.用活化的TAK1-TAB1激酶與組蛋白H3蛋白進(jìn)行體外激酶反應(yīng),Western blotting檢測(cè)TAK1能否體外磷酸化組蛋白H3。 3.CNEl細(xì)胞轉(zhuǎn)染LMP1基因,免疫熒光和免疫共沉淀法檢測(cè)TAK1和Ser10磷酸化組蛋白H3在細(xì)胞內(nèi)定位及其結(jié)合情況。 4.構(gòu)建針對(duì)TAK1基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒,與pcDNA6-Myc/HisB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞,殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定沉默TAK1基因的CNE1細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)TAK1基因沉默效果。 5. Western blotting檢測(cè)TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1對(duì)LMP1誘導(dǎo)組蛋白H3磷酸化的影響。 6.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1對(duì)LMP1誘導(dǎo)AP-1轉(zhuǎn)錄激活的影響。 7. Western blotting檢測(cè)5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAK1對(duì)LMP1誘導(dǎo)MAPK通路激酶ERK1/2、p38和MSK1磷酸化水平的影響。 結(jié)果 1.LMP1增強(qiáng)CNE1細(xì)胞TAKl激酶活性 采用TAK1抗體免疫沉淀TAK1蛋白,Western blotting結(jié)果顯示,TAK1抗體能有效地將蛋白提取液中TAK1激酶下拉。體外激酶活性分析顯示,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)染LMP1基因能夠增強(qiáng)CNE1細(xì)胞中TAK1激酶活性。 2.活化的TAK1-TAB1激酶體外磷酸化組蛋白H3 Western blotting結(jié)果顯示,活化的TAK1-TAB1激酶能引起組蛋白H3Ser10磷酸化水平的增高,呈劑量依賴關(guān)系,提示TAK1-TAB1激酶能在體外磷酸化組蛋白H3。 3.TAK1與Ser10磷酸化組蛋白H3可能不存在細(xì)胞內(nèi)共定位 免疫熒光結(jié)果顯示,在LMP1誘導(dǎo)下,TAK1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,未見有明顯核轉(zhuǎn)移,提示TAK1與磷酸化組蛋白H3可能不存在細(xì)胞核內(nèi)共定位。免疫共沉淀結(jié)果顯示TAK1與磷酸化組蛋白H3未見有明顯結(jié)合。 4.穩(wěn)定干擾TAKl基因表達(dá)的CNE1細(xì)胞株的建立 經(jīng)殺稻瘟菌素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blotting檢測(cè)TAK1基因沉默效果,結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,siRNA-TAK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞中TAK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)70%-80%。 5.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化 Western blotting結(jié)果顯示,與未處理組細(xì)胞相比,給予TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol作用細(xì)胞可降低LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化水平,呈劑量依賴關(guān)系,而H3Ser28磷酸化水平未見明顯改變。TAK1siRNA結(jié)果與其一致。 6.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活 雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,與未處理組細(xì)胞相比,給予5z-7-oxozeaenol作用細(xì)胞可降低LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄活性,呈劑量依賴關(guān)系。同樣,采用siRNA干擾TAK1基因表達(dá)亦可明顯抑制LMP1誘導(dǎo)的AP-1轉(zhuǎn)錄激活,與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,其轉(zhuǎn)錄活性下降59.38%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。 7.5z-7-oxozeaenol或基因沉默TAKl抑制LMP1誘導(dǎo)的p38和MSK1磷酸化 Western blotting結(jié)果顯示,給予5z-7-oxozeaenol處理或基因沉默TAK1均能有效抑制LMP1誘導(dǎo)的CNE1細(xì)胞p38和MSK1激酶的磷酸化水平,而ERK1/2磷酸化水平未見明顯改變,提示TAK1通過p38MAPK通路,而不是ERK1/2,調(diào)控MSK1活性。 結(jié)論 1.鼻咽癌組織中組蛋白H3Ser10磷酸化水平明顯增高；EBV-LMP1可誘導(dǎo)CNE1細(xì)胞組蛋白H3Ser10磷酸化。 2.組蛋白H3,尤其是Ser10磷酸化,在LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化中起重要調(diào)控作用,與其介導(dǎo)AP-1活性有關(guān)。 3.MSK1作為組蛋白H3激酶,直接調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的CNE1細(xì)胞組蛋白H3Ser10磷酸化；并在LMP1促進(jìn)CNE1細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用,有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。 4.TAK1通過激活p38MAPK/MSK1通路參與調(diào)控LMP1誘導(dǎo)的組蛋白H3Ser10磷酸化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1785509