本文選題：視網(wǎng)膜色素變性 + 糖基化��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2013年博士論文

【摘要】：目的:視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是遺傳性視覺損害和致盲的常見原因之一,其主要病理特征為視網(wǎng)膜感光細胞進行性的變性和不可逆轉(zhuǎn)的死亡,且臨床異質(zhì)性較高,有多種遺傳方式。最近研究發(fā)現(xiàn)一種新的導致無癥狀進展性RP 的基因 DHDDS(dehydrodolichol diphosphate synthase)K42E 突變。DHDDS 是脫氫長萜基二磷酸合成酶是一種高度保守的長醇合成酶,催化順-戊二烯鏈的延長形成長醇骨架(Dedol-PP),在糖基化過程中起到關鍵作用。為了進一步研究脫氫長萜基二磷酸合成酶和糖基化過程在視網(wǎng)膜組織的作用,本研究通過建立DHDDS完全性基因敲除和條件性基因敲除小鼠動物模型和使用糖基化抑制劑衣霉素(Tunicamycin,TM)阻斷視網(wǎng)膜糖基化,觀察分析其表型,明確糖基化障礙作為一種新的RP發(fā)病機制。方法:1.將含有插入"SA-βgeo-pA"片段導致無義突變DHDDStmla等位基因的小鼠胚胎干細胞經(jīng)顯微注射胚囊中,發(fā)育出生5只嵌合基因小鼠(chimericmice)。將嵌合基因小鼠與野生型小鼠交配,產(chǎn)生攜帶有DHDDStmla的第一代子代(F1)轉(zhuǎn)基因小鼠。2.將DHDDSfl/fl與表達重組酶Cre(recombinase)的兩種工具鼠合籠,產(chǎn)生在LMOP 啟動子(long-mouse opsin promotor)和 Chx10 啟動子驅(qū)動下,Cre 重組酶特異性識別loxP位點重組后敲除DHDDS基因中第4外顯子,產(chǎn)生分別在發(fā)育期神經(jīng)視網(wǎng)膜和成熟的視網(wǎng)膜感光細胞內(nèi)條件性DHDDS基因敲除小鼠。3.記錄暗適應和明適應條件下的視網(wǎng)膜電圖(Electroniretinograms,ERG),檢測視網(wǎng)膜功能學變化。按不同月齡為觀察點取視網(wǎng)膜組織行塑料切片染色光鏡下觀察。4.將在500bp鼠視紫紅質(zhì)(murine rhodopsin)啟動子驅(qū)動下表達Cre重組酶的AAV2病毒注射入DHDDSf1/fl小鼠視網(wǎng)膜下間隙內(nèi),Cre特異識別DHDDS基因的第四外顯子兩側內(nèi)含子區(qū)域兩個同向的loxP位點,致使基因DHDDS第4外顯子被選擇性敲除,得到DHDDS條件性敲除小鼠。注射后1個月,用免疫熒光的方法檢測病毒轉(zhuǎn)染細胞表達Cre及GFP(green fluorescent protein)的定位情況。注射后1個月、2個月按不同月齡為觀察點小鼠行視網(wǎng)膜組織塑料切片染色光鏡下觀察。5.衣霉素(tunicamycin,TM)溶于DMSO后以濃度為25ng/μl及50ng/μl注射入成年Balb/c小鼠玻璃體腔2μl。注射藥物1周、2周、4周為觀察點小鼠行相干光斷層掃描(OCT)、ERG、視網(wǎng)膜組織塑料切片染色光鏡下觀察。用Western Blotting方法檢測視網(wǎng)膜感光細胞內(nèi)蛋白視紫紅質(zhì)的表達變化,進一步明確糖基化在視網(wǎng)膜感光細胞的作用和機制。結果:1.轉(zhuǎn)基因小鼠DHDDS+/-視網(wǎng)膜組織發(fā)育完整,形態(tài)結構正常。視網(wǎng)膜電圖ERG結果顯示視網(wǎng)膜功能正常。觀察DHDDS+/-、鼠后代胚胎發(fā)育第7日,1/4胚胎形態(tài)異常,未出現(xiàn)胚盤結構,內(nèi)外胚層結構模糊紊亂,且DHDDS+/-小鼠回交后代未發(fā)現(xiàn)子代出現(xiàn)DHDDS-/-小鼠基因型,推測DHDDS-/-為胚胎致死。2.DHDDSfl/LMOP-Cre小鼠和DHDDSfl/Chx10-Cre小鼠均表現(xiàn)出視網(wǎng)膜感光細胞的結構異常,出現(xiàn)變性死亡,ERG示視網(wǎng)膜感光細胞功能異常。3.AAV-Rho-GFP注射眼視網(wǎng)膜感光細胞結構功能未見異常。AAV-Rho-Cre注射眼視網(wǎng)膜感光細胞變性死亡減少。4.衣霉素玻璃體腔注射后一個月內(nèi),50ng組和100ng組均出現(xiàn)感光細胞變性凋亡減少,ERG示感光細胞功能異常。蛋白免疫分析證實,感光細胞中視紫紅質(zhì)被去糖基化。結論:DHDDS基因介導的蛋白質(zhì)糖基化過程在生命初期生物體胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。DHDDS基因缺失或異常導致蛋白質(zhì)糖基化這一蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程失敗,可引起視網(wǎng)膜變性疾病。TM阻滯視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)糖基化后亦出現(xiàn)視網(wǎng)膜變性,感光細胞死亡,視網(wǎng)膜功能喪失。感光細胞對于糖基化長醇通路障礙十分敏感,糖基化長醇通路機制是視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)病的可能機制之一。
[Abstract]:Objective : To study the role of DHDDS ( DHDDS ) as a new RP gene . Results : 1 . DHDDS + / - retinal tissue was developed intact and its morphology was normal . The results showed that DHDDS + / - retinal tissue was completely developed and its morphology was normal .

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1

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本文編號：1737301