發(fā)布時間：2018-04-11 17:34

  本文選題：鞘氨醇-1-磷酸1 + 角膜移植��； 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2014年博士論文

【摘要】：目的： 通過手術(shù)方法建立小鼠同種異體角膜移植模型，予以局部應(yīng)用鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑1（S1P1），觀察S1P1對小鼠角膜移植片免疫排斥的影響，并與臨床常用的眼用免疫抑制劑地塞米松（DXM），雷帕霉素（Rapa）和環(huán)孢霉素A（CsA）進行比較，最終明確S1P1抑制小鼠角膜移植排斥反應(yīng)的效果；通過檢測小鼠體內(nèi)及角膜植片內(nèi)樹突細胞相關(guān)的免疫因子水平和蛋白的表達，，探索S1P1抑制角膜植片免疫排斥的作用機制；探索局部S1P1聯(lián)合用藥對小鼠角膜移植術(shù)后免疫排斥的影響。 方法： 1、利用經(jīng)典手術(shù)方法建立以雄性C57BL/6小鼠（24只）為供體，雄性BALB/C小鼠（48只）為受體的同種異體角膜移植實驗?zāi)Ｐ停恐恍∈箅S機選取一眼作為受體眼，分別接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并隨機分為六組（A、B、C、D、E和F組），每組8只，A組為不含藥物的安慰劑眼液對照組，B組為0.25%S1P1混懸眼液組，C組為0.5%S1P1混懸眼液組，D組為0.1%地塞米松眼液組，E組為0.4%雷帕霉素眼液組，F(xiàn)組為1%環(huán)孢霉素A眼液組。各組術(shù)后分別采用局部眼表點藥，每日4次（8-12-16-20點），持續(xù)給藥直至角膜植片發(fā)生排斥。術(shù)后10-11天于手術(shù)顯微鏡下拆除小鼠角膜移植縫線，術(shù)后每日觀察小鼠角膜植片變化情況，至發(fā)生角膜排斥后處死實驗動物。 2、建立以雄性C57BL/6小鼠（15只）為供體，雄性BALB/C小鼠（30只）為受體的同種異體角膜移植實驗?zāi)Ｐ�。每只小鼠隨機選取一眼作為受體眼，分別接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并隨機分為五組（G、H、I、J和K組），每組6只。G組為不含藥物的安慰劑眼液對照組，H組為0.5%S1P1混懸眼液組，I組為0.1%地塞米松眼液組，J組為0.4%雷帕霉素組，K組為1%環(huán)孢霉素A眼液組。術(shù)后分別給予上述方案分組方案處置，術(shù)后10-11天拆除角膜縫線。并于術(shù)后14d時處死全部小鼠，取單側(cè)頸部引流淋巴結(jié)、外周血、脾臟等行流式細胞學檢測，探討CD11c+、MHC-II+和CD86+DCs細胞的分布和聚集狀態(tài)。取外周血血清行Elisa檢查IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4水平；每組取3只小鼠角膜，提取總RNA，行Realtime-PCR檢查各組植片中IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4mRNA的表達情況；每組取3只小鼠角膜分別進行常規(guī)HE染色，了解角膜排斥反應(yīng)情況，行免疫組化檢查了解MHC-II+DCs和CD86+DCs細胞在角膜植片中的的分布及浸潤情況。3、建立以雄性C57BL/6小鼠（16只）為供體，雄性BALB/C小鼠（32只）為受體的同種異體角膜移植實驗?zāi)Ｐ停∈箅S機選取一眼作為受體眼，分別接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并隨機分為四組（L、M、N和O組），每組8只。L組為不含藥物的安慰劑眼液對照組，M組為0.1%地塞米松眼液組，N組為0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合0.4%雷帕霉素眼液組，O組為0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合1%環(huán)孢霉素眼液組。自手術(shù)后第一日開始，分別給予局部眼表點藥，每日4次（8-12-16-20點），聯(lián)合給藥組兩種眼藥給藥間隔為10分鐘，持續(xù)給藥至角膜發(fā)生排斥。術(shù)后10-11天拆除角膜縫線。術(shù)后每日對各組小鼠移植后角膜排斥時間進行觀察并照相，記錄植片情況，繪制生存曲線，至發(fā)生角膜排斥后予過量麻醉處死實驗動物。 結(jié)果： 1、對48只同種異體角膜移植小鼠術(shù)后角膜植片進行統(tǒng)計分析，空白對照組角膜植片平均存活時間為16.8±1.7天(n=8)；0.25%S1P1眼液組角膜植片平均存活時間為17.8±1.9天（p0.01, n=8）；0.5%S1P1眼液組角膜植片平均存活時間為27.6±3.3天（p0.01, n=8）；0.1%地塞米松眼液組角膜植片平均存活時間為31.9±4.3天（p0.01, n=8）；0.4%雷帕霉素眼液組角膜植片平均存活時間為25.1±4.0天（p0.01, n=8）；1%環(huán)孢霉素A組角膜植片平均存活時間為25.8±4.2天（p0.01, n=8）。 2、與空白對照組相比較，0.25%S1P1眼液組植片存活時間有所延長，但無統(tǒng)計學差異（P0.05）；0.5%S1P1眼液組、0.1%地塞米松眼液組、0.4%雷帕霉素眼液組、1%環(huán)孢霉素A眼液組植片存活時間明顯延長，并且有顯著性差異（P0.01）。與0.5%S1P1眼液組相對比，0.1%地塞米松眼液組植片存活時間明顯延長，有統(tǒng)計學差異（P0.05）;0.4%雷帕霉素眼液組、1%環(huán)孢霉素A眼液組植片存活時間無延長，且無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 3、局部應(yīng)用0.5%S1P+1眼液可顯著增加外周血中MHC-IICD11c+細胞比例（P0.01），顯著降低頸部淋巴結(jié)中MHC-II+CD11c+細胞和MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.05）。 4、局部應(yīng)用0.1%地塞米松眼液可顯著增加外周血中MHC-II+CD11c+細胞比例（P0.01）和顯著降低脾臟中MHC-II+CD11c+細胞比例（P0.05），顯著降低頸部淋巴結(jié)中MHC-II+CD11c+細胞和MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.05和P0.01）。 5、局部應(yīng)用0.4%雷帕霉素眼液可顯著降低外周血中和頸部淋巴結(jié)中MHC-II+CD11c+細胞比例（P0.05），顯著增加外周血中MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.01），顯著降低頸部淋巴結(jié)中MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.01），顯著降低脾臟中MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.05）。 6、局部應(yīng)用1%環(huán)孢霉素A眼液可顯著降低外周血中和頸部淋巴結(jié)中MHC-II+CD11c+細胞和MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.05， P0.01；分別地），顯著增加脾臟中MHC-II+CD86+細胞的比例（P0.05）。 7、外周血血Elisa檢查，對比空白對照組，0.5%S1P1眼液組、0.1%地塞米松眼液組、0.4%雷帕霉素眼液組和1%環(huán)孢霉素A眼液組的IL-2、IL12、IFN-γ、TGF-β1和CTLA-4水平均無顯著性差異（P0.05）。 8、各組植片中，對比空白組，1%環(huán)孢霉素A眼液組植片中IL-2mRNA和IFN-γmRNA表達量顯著下降（P0.05）；0.5%S1P1眼液組植片中TGF-β1mRNA和CTLA-4mRNA表達量顯著增加（P0.05），IL-12mRNA表達量顯著下降（P0.05）。 9、小鼠角膜植片HE染色和免疫組化檢查提示：空白對照組顯著水腫增厚、大量炎性細胞浸潤，植片上皮和基質(zhì)內(nèi)大量CD86+DCs和MHC-II+DCs細胞增值浸潤；0.5%S1P1眼液組上皮輕度水腫，基質(zhì)層輕度增厚，植片內(nèi)分布較多炎癥細胞，植片上皮內(nèi)可見少許CD86+DCs和MHC-II+DCs細胞增殖浸潤；0.1%地塞米松眼液組角膜植片可見上皮輕度水腫，基質(zhì)層輕度水腫增厚，植片內(nèi)亦可見較多炎癥細胞，植片基質(zhì)層內(nèi)可見少許CD86+DCs和MHC-II+DCs細胞增殖浸潤；0.4%雷帕霉素眼液組上皮中度水腫，基質(zhì)層無明顯水腫，植片內(nèi)亦可見較多炎癥細胞，植片上皮層和淺層基質(zhì)層內(nèi)可見少許CD86+DCs和MHC-II+DCs細胞增殖浸潤；1%環(huán)孢霉素A眼液組角膜植片可見上皮輕度水腫，基質(zhì)層無明顯水腫，植片內(nèi)散在分布少量炎癥細胞，角膜植片上皮層內(nèi)可見少許CD86+DCs和MHC-II+DCs細胞增殖浸潤。 10、0.5%S1P1眼液聯(lián)合用藥實驗中，空白對照組角膜植片平均存活時間為16.5±2.3天（n=8）；0.1%地塞米松眼液組角膜植片平均存活時間為32.7±4.0天（p0.01, n=8）；0.5%S1P1+0.4%雷帕霉素眼液組角膜植片平均存活時間為31.8±3.8天（p0.01, n=8）；0.5%S1P1+1%環(huán)孢霉素A眼液組角膜植片平均存活時間為33.1±3.9天（p0.01, n=8）。 11、0.5%S1P1眼液聯(lián)合用藥實驗中，與空白對照組相比，0.1%地塞米松眼液組，0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合0.4%雷帕霉素眼液組，0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合1%環(huán)孢霉素A眼液組均可延長植片的平均存活時間，且具有顯著性差異（P0.01）；三個治療組相比，在角膜植片術(shù)后平均生存時間方面，0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合1%環(huán)孢霉素A眼液組優(yōu)于0.1%地塞米松眼液組，而0.1%地塞米松眼液組優(yōu)于0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合雷帕霉素眼液組，但是三組在統(tǒng)計學上無顯著性差異（P0.05）。 結(jié)論： 1、在同種異體小鼠角膜移植模型中，局部使用0.5%S1P1眼液，0.4%雷帕霉素眼液和1%環(huán)孢霉素A眼液均可顯著延遲小鼠角膜植片的平均存活時間，但三治療組之間無統(tǒng)計學差異。 2、同以上三個治療組相比，0.1%地塞米松眼液組可以更好地延遲小鼠角膜植片的平均存活時間，并且有統(tǒng)計學差異。 3、0.5%S1P1眼液顯著增加外周血中成熟DCs比例，減少頸部引流淋巴結(jié)中的成熟DCs的比例。0.5%S1P1眼液可以顯著降低DCs的抗原提成能力。 4、0.5%S1P1眼液對外周血清中IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4等細胞因子水平無影響。 5、0.5%S1P1眼液顯著上調(diào)小鼠角膜植片內(nèi)的TGF-β1和CTLA-4mRNA的表達量，顯著下調(diào)IL-12mRNA的表達量。 6、0.5%S1P1眼液顯著減少角膜植片基質(zhì)層和內(nèi)皮層的炎癥細胞的浸潤；0.5%S1P1眼液能顯著減少角膜植片中成熟DCs的浸潤。 7、在同種異體小鼠角膜移植術(shù)后聯(lián)合用藥方案中，0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合1%環(huán)孢霉素A眼液組小鼠角膜植片平均存活時間最長，兩者具有協(xié)同免疫抑制作用。 8、0.5%S1P1混懸眼液聯(lián)合1%環(huán)孢霉素A眼液可以替代0.1%地塞米松眼液抗同種異體小鼠角膜移植術(shù)后排斥。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R779.65

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本文編號：1736987