發(fā)布時間：2018-04-11 14:52

  本文選題：炎性分子 + 高滲��； 參考：《濟(jì)南大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：通過體外使用炎性分子和高滲透壓處理小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系（TKE2）和原代兔角膜緣干細(xì)胞，分別模擬持續(xù)性炎癥和干眼高滲因素，研究其對角膜上皮干細(xì)胞活性的不同影響及其可能的機(jī)制。 方法：1.體外角膜上皮干細(xì)胞模型的建立：（1）小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2)：采用含BPE和EGF的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）原代兔角膜緣干細(xì)胞：新西蘭大白兔6只，耳緣靜脈空氣栓塞處死后剪取其眼球，無菌條件下Dispase-Trypsin/EDTA消化法分離獲得原代兔角膜緣干細(xì)胞，將細(xì)胞以1000個/孔的密度接種于6孔板中，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2．炎性分子對角膜上皮干細(xì)胞活性的影響：用10ng/ml IFN-γ，IL-1β或TNF-α處理角膜上皮干細(xì)胞8天，篩選對細(xì)胞克隆形成能力影響較大的炎性分子。采用篩選出的IL-1β進(jìn)行進(jìn)一步研究，用不同濃度的IL-1β（0，1，5，10，20ng/ml）處理角膜上皮干細(xì)胞8天，檢測其對細(xì)胞克隆形成能力及細(xì)胞生存能力的影響。 3．高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性的影響：通過不同濃度的NaCl（0，10，30，60，90mM）處理角膜上皮干細(xì)胞8天，檢測其對細(xì)胞克隆形成能力及細(xì)胞生存能力的影響。 4．炎性分子和高滲因素共同作用對角膜上皮干細(xì)胞克隆形成能力的影響：用10ng/ml IL-1β復(fù)合不同濃度的NaCl處理角膜上皮干細(xì)胞8天，檢測兩種不同因素的疊加對細(xì)胞克隆形成能力的影響。 5.炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性影響的可能機(jī)制研究：通過研究IL-1β或NaCl處理對角膜上皮干細(xì)胞細(xì)胞凋亡和壞死、細(xì)胞周期分布、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)及活性氧（ROS）水平等方面的影響來探討炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性影響的可能機(jī)制。 結(jié)果：1．三種不同炎性分子處理TKE2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與對照或IFN-γ處理相比，IL-β和TNF-α處理能顯著影響TKE2細(xì)胞的克隆形成能力和克隆集落大小。用不同濃度IL-1β或NaCl處理TKE2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨IL-1β和NaCl濃度的增加，TKE2細(xì)胞克隆形成率和集落直徑的減小呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)；且IL-1β或NaCl同樣能夠顯著影響兔原代角膜緣干細(xì)胞的克隆形成能力。而當(dāng)IL-1β與不同濃度的NaCl共同處理TKE2細(xì)胞時，其克隆形成效率和集落直徑比單獨(dú)用IL-1β處理時減小的更為顯著。不同濃度IL-1β或NaCl處理TKE2細(xì)胞能夠不同程度的影響細(xì)胞的存活，其中高濃度的NaCl對細(xì)胞的存活影響更大。 2．高濃度的NaCl（60mM）會造成顯著的細(xì)胞凋亡和壞死，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期；而IL-1β幾乎不造成細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的改變。IL-1β和NaCl可下調(diào)TKE2細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物ΔNp63的表達(dá)，且NaCl可明顯上調(diào)分化上皮細(xì)胞標(biāo)記物involucrin的表達(dá)。IL-1β和NaCl處理均可升高TKE2細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。 結(jié)論：1.炎性分子IL-1β可抑制角膜上皮干細(xì)胞的克隆形成能力。 2. NaCl模擬的高滲透壓微環(huán)境下，干細(xì)胞表現(xiàn)為早期凋亡甚至壞死，細(xì)胞周期阻滯。 3.炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細(xì)胞活性的影響可能與其過度活化細(xì)胞內(nèi)ROS的水平相關(guān)。
[Abstract]:Objective : To study the effects of inflammatory and high osmotic pressure on corneal epithelial stem / progenitor cell line ( TKE2 ) and primary rabbit corneal limbal stem cells in vitro .

Methods : 1 . Establishment of the model of corneal epithelial stem cells in vitro : ( 1 ) Mouse corneal epithelial stem / progenitor cell line ( TKE2 ) : cultured with the culture medium containing BPE and EGF ;
( 2 ) The corneal limbal stem cells of the primary rabbit : 6 rabbits in New Zealand white rabbits , after the ear marginal venous air embolism were killed , the eyeball was cut and the corneal limbal stem cells of the primary rabbit were separated under sterile conditions . The cells were inoculated into 6 - well plates at a density of 1000 cells / well , and cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fetal bovine serum .

2 . The effect of inflammatory molecules on corneal epithelial stem cell activity was studied by using 10 ng / ml IFN - 緯 , IL - 1尾 or TNF - 偽 in the treatment of corneal epithelial stem cells for 8 days . The results showed that IL - 1尾 ( 0 , 1 , 5 , 10 , 20 ng / ml ) was used to treat corneal epithelial stem cells for 8 days . The effects of different concentrations of IL - 1尾 ( 0 , 1 , 5 , 10 , 20 ng / ml ) on the formation of cell clones and cell viability were examined .

3 . The effect of hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity was studied by treating corneal epithelial stem cells with different concentrations of NaCl ( 0 , 10 , 30 , 60 , 90 mM ) for 8 days .

4 . The effects of inflammatory and hyperosmotic factors on the formation of corneal epithelial stem cell clones were studied . The effects of two different factors on the formation of corneal epithelial stem cells were studied by treating corneal epithelial stem cells with 10 ng / ml IL - 1尾 compound at different concentrations for 8 days .

5 . Possible mechanisms of inflammatory and hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity : The possible mechanism of inflammatory and hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity was investigated by investigating the effects of IL - 1尾 or NaCl on corneal epithelial stem cell apoptosis and necrosis , cell cycle distribution , stem cell marker expression and reactive oxygen ( ROS ) levels .

Results : 1 . TKE2 cells were treated with three different inflammatory molecules . Compared with control or IFN - 緯 treatment , IL - 1尾 and TNF - 偽 treatment could significantly affect the clonal formation and colony size of TKE2 cells .
When IL - 1尾 and NaCl were treated with different concentrations of NaCl to deal with TKE2 cells , the colony forming efficiency and colony diameter were more significant than that of IL - 1尾 alone . Different concentrations of IL - 1尾 or NaCl treated TKE2 cells could influence the survival of the cells in different degrees , and the high concentration of NaCl had a greater effect on the survival of the cells .

2 . High concentration of NaCl ( 60 mM ) can cause significant apoptosis and necrosis , and the cell cycle arrest in G2 / M phase ;
IL - 1尾 and NaCl could down - regulate the expression of the marker 螖Np63 of TKE2 cell stem cell marker , and NaCl could significantly increase the expression of the differentiation epithelial cell marker 螖Np63 . Both IL - 1尾 and NaCl treatment could increase the level of ROS in TKE2 cells .

Conclusion : 1 . IL - 1尾 can inhibit the formation of corneal epithelial stem cells .

2 . Under the high osmotic pressure microenvironment of NaCl simulation , the stem cells showed early apoptosis or even necrosis and cell cycle arrest .

3 . The influence of inflammatory molecules and hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity may be related to the level of ROS in over - activated cells .

【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R772.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1736454