本文選題：鼻咽癌　切入點：miRNA　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：背景： 小RNA分子是長度為21-25個核苷酸左右的非編碼的RNA (noncoding RNA, ncRNA),控制著真核細(xì)胞的許多功能,影響基因表達(dá)、細(xì)胞周期和個體發(fā)育等多種行為。小RNA主要包括微RNA(microRNA, miRNA)和小干擾RNA (short interfering RNA, siRNA)兩類,其中miRNA成為繼siRNA之后新的研究熱點之一 MiRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其結(jié)構(gòu)上主要有三個特點：(1)本身不具有開放閱讀框架(ORF)及蛋白質(zhì)編碼基因的特點。(2)大小長約21-25個核苷酸。(3)有獨特的特征序列。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的,隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體,通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA,并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。研究證明,miRNA在生物體的物質(zhì)代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、凋亡、個體形態(tài)的形成和發(fā)育等一系列重要生命活動的調(diào)控過程中扮演著重要的角色。此外,miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大約50%的miRNA位于腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域,包括LOH區(qū)、染色體擴(kuò)增區(qū)及脆性位點等,參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、粘附、血管生成等生物學(xué)過程的調(diào)控,在腫瘤發(fā)生的基因水平調(diào)控方面發(fā)揮了廣泛而重要的作用。miRNA的異常表達(dá)直接參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,現(xiàn)今一些作為原癌基因、腫瘤抑制基因和腫瘤轉(zhuǎn)移基因的miRNA已被鑒定出來,這將有助于理解miRNA在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,同時也為尋找腫瘤特異性診斷的標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點提供了思路。 病毒是專一性細(xì)胞內(nèi)病原體,與多種動植物的疾病有關(guān)。病毒能否正常生長復(fù)制,關(guān)鍵在于它們能否抑制宿主固有免疫防御,或者逃避宿主先天性或適應(yīng)性免疫清除作用,比如干擾素樣反應(yīng)和凋亡反應(yīng)。為達(dá)到這一目的,絕大多數(shù)病毒是通過編碼特異性滅活宿主細(xì)胞防御的蛋白來實現(xiàn)的。最近的研究證實：病毒也可能通過合成自身的miRNA來關(guān)閉自身或宿主特異性基因的表達(dá),從而優(yōu)化自身生存環(huán)境,更易導(dǎo)致感染或病毒相關(guān)腫瘤的發(fā)生。這種由病毒編碼產(chǎn)生的miRNA引起了人們廣泛的關(guān)注。 EB病毒是第一個被發(fā)現(xiàn)編碼miRNA的病毒。2004年,Pfeffer等首次在EB病毒中分離出小RNA屬人皰疹病毒家族成員,經(jīng)研究表明其在病毒感染宿主過程中起作用,他們將這些miRNA分別命名為miR-BHRF1-1、miR-BHRF1-2、miR-BHRF1-3、miR-BART1和miR-BART2,這是最早發(fā)現(xiàn)的病毒編碼的miRNA分子。隨后一年,Pfeffer等又經(jīng)過計算分析與實驗研究從29種病毒中識別出33條編碼產(chǎn)生的病毒miRNA。Pfeffer等的發(fā)現(xiàn)使病毒miRNA研究成為一個新的研究熱點,開辟了新的研究領(lǐng)域分支,為病毒miRNA分子調(diào)控宿主基因表達(dá)和病毒自身基因表達(dá)提供了新方向和新內(nèi)容,也向病毒與宿主細(xì)胞間相互作用新模式的研究邁出了重要的一步。目前所鑒定的miRNA所屬病毒絕大多數(shù)屬致腫瘤病毒,因此,可以推測病毒miRNA與腫瘤關(guān)系密切。病毒致瘤新學(xué)說認(rèn)為：病毒miRNA分子的序列恰好是針對宿主細(xì)胞中腫瘤抑制基因,如EB病毒miR-BHRF1具有與腫瘤抑制基因P53結(jié)合的潛在位點,與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2mRNA3'端非編碼區(qū)的結(jié)合位點,從而參與調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖,這可能會導(dǎo)致宿主抑癌基因功能的喪失和免疫監(jiān)視功能的失常,最終引起腫瘤的發(fā)生。另有報道,EBV-miR-BART5與宿主細(xì)胞的PUMA基因結(jié)合,抑制細(xì)胞凋亡,60%鼻咽癌病人有PUMA表達(dá)顯著下降。在調(diào)節(jié)自身基因方面,據(jù)預(yù)測,EB病毒miR-BART2是來自其DNA聚合酶(BALF5)轉(zhuǎn)錄本反義鏈,具有與BALF53’端UTR完全互補(bǔ)的序列,因此可能指導(dǎo)BALF5 mRNA降解和調(diào)控BALF5基因表達(dá),導(dǎo)致宿主處于隱性感染狀態(tài)。研究表明,全長5.0kb BALF5 mRNA的加工降解產(chǎn)物3.7 kb片段,其3’端序列與Pfeffer等人預(yù)測的miR-BART2指導(dǎo)的裂解位點非常吻合。此外,miR-BART2可與BMLF1 (EB2)mRNA 3'端結(jié)合,miR-BART1可與BBLF4和LMP2A mRNA的3’端結(jié)合,從而達(dá)到調(diào)節(jié)病毒自身基因表達(dá)的目的；在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面,EBV-miR-BHRF1-3可與干擾素可誘導(dǎo)的T細(xì)胞趨化因子CXCL-11結(jié)合,逃避免疫監(jiān)視。 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是指發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤。中國的廣東、廣西、福建、湖南等地為高發(fā)區(qū)。發(fā)病年齡大多為中年人,亦有青少年患病者。鼻咽癌惡性程度較高,早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究表明,EB病毒感染與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān),在大部分角化鱗狀細(xì)胞癌和幾乎所有未分化的鱗狀細(xì)胞癌都有EB病毒的存在。全世界90%以上的人感染過EB病毒,但只有少部分成年后有鼻咽癌的發(fā)生,其致病機(jī)理尚不完全清楚。 查閱最新文獻(xiàn),EBV-miRNA與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制方面的研究甚少。本課題首先應(yīng)用miRNAs表達(dá)譜芯片檢測并篩選出鼻咽癌組織(NPC)和非癌鼻咽組織(慢性鼻咽炎,NP)中差異表達(dá)較大的EBV-miRNA,構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體,病毒包裝后感染CNE1細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分選鑒定GFP+細(xì)胞,建立了穩(wěn)定過表達(dá)EBV-miR-BART7鼻咽癌細(xì)胞株,觀察其對鼻咽癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等生物學(xué)行為的影響,同時通過干擾回復(fù)試驗進(jìn)行驗證,并應(yīng)用RNA-seq(轉(zhuǎn)錄組學(xué))方法初步尋找可能的與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的靶基因。本研究有可能為鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和治療策略研究提供新思路。 方法： 一.應(yīng)用miRNAs表達(dá)譜芯片檢測NPC組織和NP組織中差異表達(dá)的EBV-miRNA。 二.選取具有顯著表達(dá)差異的EBV-miR-BART7做為進(jìn)一步研究對象,采用Real-time PCR方法進(jìn)一步驗證其在NPC組織和NP組織中的表達(dá)水平。 三.分析EBV-miR-BART7過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞株CNE1生物學(xué)特性的影響。 構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLVTHM/EBV-miR-BART7,病毒包裝后感染CNE1細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分選GFP+細(xì)胞,建立了穩(wěn)定過表達(dá)EBV-miR-BART7的鼻咽癌細(xì)胞株CNE1-BART7,通過MTT生長曲線法檢測過表達(dá)前后其增殖活性的變化,Transwell和Boyden小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期有無變化。 四.干擾回復(fù)實驗。 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將化學(xué)合成的EBV-miR-BART7阻遏物(EBV-miR-BART7 inhibitors)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞株CNE1-BART7中,通過Transwell和Boyden小室檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。 五.利用RNA-seq技術(shù),初步分析EBV-miR-BART7可能介導(dǎo)的候選靶基因。 結(jié)果： 一.miRNAs芯片結(jié)果顯示,一些EBV-miRNA在NPC中的表達(dá)明顯高于NP組織,其中EBV-miR-BART7差異表達(dá)變化最大,為正常組織的30倍以上,故選取其做為進(jìn)一步的研究對象。 二.采用Real-time PCR驗證NPC組織和NP組織中ebv-miR-BART7的表達(dá)情況。NPC組織中EBV-miR-BART7的表達(dá)高于NP組織,表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=29.445,P0.001)。 過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞株CNE1生物學(xué)特性的影響。EBV-miR-BART7三. 1.MTT生長曲線 結(jié)果提示：CNE1-mock細(xì)胞和CNE1-BART7細(xì)胞體外增殖能力相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.631,P=0.428)。 2.細(xì)胞周期 結(jié)果顯示：CNE1-mock細(xì)胞和CNE1-BART7細(xì)胞的G0/G1期(t=-0.334,P=0.755)、S期(t=0.692,P=0.527)以及G2/M期(t=-0.161,P=0.880)細(xì)胞比例的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 3.遷移能力 Transwell遷移實驗：細(xì)胞培養(yǎng)17h后,CNE1-BART7細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)(100.278±19.357)多于CNE1-mock細(xì)胞(22.444±5.204),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.475,P0.001)。表明CNE1-BART7細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力較CNE1-mock細(xì)胞強(qiáng),EBV-miR-BART7可能參與了鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程。 4.侵襲能力 Boyden小室侵襲實驗：細(xì)胞培養(yǎng)24h后,CNE1-BART7細(xì)胞穿過鋪有matrigel基質(zhì)膠聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)(78.900±9.132)多于CNE1-mock細(xì)胞(26.056±4.425),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.088,P0.001)。表明CNE1-BART7細(xì)胞侵襲運(yùn)動能力較CNE1-mock細(xì)胞強(qiáng),EBV-miR-BART7可能參與了鼻咽癌的侵襲過程。 四.干擾回復(fù)實驗 1.遷移能力 Transwell遷移實驗：EBV-miR-BART7 inhibitor轉(zhuǎn)染后24h消化細(xì)胞,細(xì)胞置于小室中繼續(xù)培養(yǎng)17h后,CNE1-BART7-NC細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)(136.060±10.166)多于CNE1-BART7-inhibitor細(xì)胞(60.000±10.047),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.576,P0.001)。 2.侵襲能力 Boyden小室侵襲實驗：EBV-miR-BART7 inhibitor轉(zhuǎn)染后24h消化細(xì)胞,細(xì)胞置于帶有matrigel基質(zhì)膠的小室中繼續(xù)培養(yǎng)24h后,CNE1-BART7-NC細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)(130.110±6.833)多于CNE1-B ART7-inhibitor細(xì)胞(72.560±8.459),兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.456,P0.001)。 五.宿主靶基因分析 利用RNA-seq分析EBV-miR-BART7可能調(diào)控的宿主靶基因,結(jié)果顯示：EBV-miR-BART7過表達(dá)后,上調(diào)基因391個,下調(diào)基因101個,它們發(fā)揮的生物學(xué)功能主要包括基質(zhì)金屬肽酶活性、氧化磷酸化、細(xì)胞骨架調(diào)控、細(xì)胞代謝、受體活性、細(xì)胞周期調(diào)控、ErbB、Wnt及TGF-beta等信號通路的調(diào)控以及凋亡、粘附因子、粘著斑和鈣結(jié)合蛋白的調(diào)控等。由于這些生物學(xué)功能涉及到了腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的多個階段,因而我們推測EBV-miR-BART7在鼻咽癌中高表達(dá)后,可通過直接或間接方式調(diào)控下游一系列靶基因的表達(dá)進(jìn)而引起鼻咽癌細(xì)胞多方面生物學(xué)特性的改變,其中與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的基因主要有RHOB. S100A2、NME1、TIMP1和MMPl等,與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的主要信號通路有TGF-β信號通、Notch信號通、Wnt信號通以及VEGF信號通路等。 結(jié)論： 一miRNAs表達(dá)譜芯片、Real-time PCR檢測和驗證EBV-miR-BART7在NPC組織中的表達(dá)高于NP組織。 二EBV-miR-BART7過表達(dá)及干擾回復(fù)實驗顯示,其與鼻咽癌細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān),而對細(xì)胞的體外增殖能力無明顯影響。 三RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)EBV-miR-BART7可能通過調(diào)控下游一些靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯引起鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的改變,參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展尤其轉(zhuǎn)移侵襲的過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1727389