本文選題：胚胎植入前遺傳學診斷　切入點：多重替代擴增技術　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院》2011年博士論文

【摘要】：耳聾是一種嚴重影響人類生活質量的常見疾病,據我國2006年殘疾人抽樣調查結果顯示聽力殘疾(含多重殘疾)人共2,780萬,并以每年新生3萬聾兒的速度增長。因此,建立能夠預防和減小后代耳聾再發(fā)風險的診斷方法和干預措施,提高防聾治聾的水平、降低人群中耳聾發(fā)病率對提高我國人口素質有著非常重要的現實和長遠意義。 高密度遺傳標記的發(fā)展和應用為人類耳聾基因定位克隆和分子流行病學研究提供了強有力的工具。截止到2011年2月,共有166個非綜合征型耳聾基因位點見諸報道(62個為常染色體顯性遺傳基因位點,96個為常染色體隱性遺傳基因位點,8個位于X染色體,1個位于Y染色體),62個非綜合征型耳聾基因和更多的綜合征性耳聾基因成功克隆。 在本研究中,我們應用單細胞全基因組多重替代擴增技術(Multiple displacement amplification, MDA)、單細胞巢氏PCR(polymerase chain reaction)、單細胞實時熒光定量PCR以及微衛(wèi)星標記(microsatellite marker, STR)連鎖分析等現代分子生物學技術建立了單細胞基因診斷的方法體系,并初步應用到遺傳性耳聾的PGD臨床工作中；另外以微衛(wèi)星分子標記(STR)作為遺傳標記,在一個常染色體顯性非綜合征型高頻頻感音神經性耳聾大家系中進行篩查并成功定位及篩查出致病基因；完成Treacher Collins綜合征致病基因的突變篩查。本研究包括如下三部分： 第一部分遺傳性耳聾胚胎植入前基因診斷技術的建立和初步臨床應用 遺傳性耳聾絕大多數為單基因特異性點突變,符合輔助生殖技術(in vitro fertilization, IVF)胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)醫(yī)學指征,可有效避免傳統(tǒng)中期妊娠異常胚胎的治療性流產對患者本人和家屬造成的身心傷害。本課題組朱玉華博士在前期研究中,鑒定了一個常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾DFNA64家系的致病基因DIABLO,該家系的先證者夫婦在了解胚胎植入前遺傳學診斷技術(PGD)可預防聾兒出生后,有進行此項研究的強烈意愿,并簽署了知情同意書。 通過對該家系先證者夫婦單淋巴細胞及他人廢棄胚胎的單卵裂球進行單細胞巢氏PCR、單細胞全基因組多重替代擴增(MDA)及后續(xù)PCR測序、實時熒光定量PCR及微衛(wèi)星標記連鎖分析等研究,初步建立了遺傳性耳聾胚胎植入前基因診斷技術體系。本課題組與北京醫(yī)科大學第三醫(yī)院輔助生殖中心劉平教授合作,對該夫婦進行了一次完整的PGD輔助生殖臨床診療流程,診斷一個健康胚胎并植入母體子宮,但未獲得成功妊娠。 第二部分非綜合征型遺傳性耳聾家系致病基因的定位研究 經表型及遺傳方式分析,將收集的SD-L030家系判定為常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾家系。選用微衛(wèi)星STR分子標記作為遺傳標記及經典連鎖分析方法,對該家系進行了耳聾致病基因的定位、篩查和鑒定工作。SD-L030家系共4代,成員共30人(包括已故和配偶)是一個常染色體顯性遺傳性耳聾家系。應用微衛(wèi)星標記對已知23個DFNA位點進行初步篩查,將該家系致聾基因定位于7p15處D7S629-D7S516之間約1.87cM的區(qū)域,與已知耳聾基因DFNA5所在區(qū)域重疊。直接測序在DFNA5基因的第7內含子中鑒定了一個新的DFNA5突變,IVS7-2AG,該突變與此家系表型共分離,通過提取外周血總mRNA并進行RT-PCR,發(fā)現該位點突變導致DFNA5第八外顯子轉錄缺失。 第三部分Treacher Collins綜合征致病基因篩查及分子機制研究 Treacher Collins綜合征(Treacher Collins syndrome, TCS)是一種常見的遺傳疾病,發(fā)病率為1/50,000,主要表現為雙側顴骨骨結構發(fā)育異常造成顱面部的發(fā)育不全。本研究對兩例TCS疑似病例進行了TCOF1基因的直接測序,一例患者攜帶TCOF1的第2外顯子c.146 TC雜合突變,此突變位點將編碼第49位的異亮氨酸替換為蘇氨酸,對其父親、母親進行該位點突變篩查,未發(fā)現突變,該位點突變?yōu)橐恍律蛔�。本研究結果為該家系下一步遺傳咨詢和產前診斷的需求提供了資料和依據。同時對TCS發(fā)病機理及該病致病基因分子機制的研究進展做了深入的分析和總結。
[Abstract]:Deafness is a common disease seriously affect the quality of human life, according to a sample survey in 2006 showed that China's disabled hearing disability (including multiple disabilities) a total of 27 million 800 thousand, and the annual growth rate of 30 thousand new children. Therefore, diagnosis and intervention measures to establish prevention and to reduce the risk of recurrent offspring deafness, improve the anti treatment of hearing loss level, reduce the incidence of hearing loss in the crowd has a very important practical and long-term significance to improve the quality of our population.
The development and application of high density genetic markers provides a powerful tool for the research of cloning and molecular epidemiology of human deafness gene location. By the end of February 2011, there are 166 types of non syndromic deafness loci reported (62 autosomal dominant genetic loci, 96 autosomal recessive genetic loci, 8 located on the X chromosome, the 1 chromosome Y), 62 non syndromic deafness syndrome gene and gene cloning more success.
In this study, we used single cell whole genome amplification multiple alternative (Multiple displacement amplification, MDA), single cell nested PCR (polymerase chain reaction), real time fluorescent quantitative PCR single cell and microsatellite markers (microsatellite, marker, STR) and linkage analysis of modern molecular biology technology to establish the diagnosis method of single cell system gene, and its preliminary application in clinical work PGD hereditary deafness; in addition to microsatellite markers (STR) as genetic markers in an autosomal dominant non syndromic high-frequency sensorineural deafness pedigree screening and successfully mapped and identified the pathogenic gene; Treacher Collins mutation screening retardation-1. This study consists of three parts:
The first part of the establishment of genetic deafness preimplantation genetic diagnosis technology and preliminary clinical application
The vast majority of genetic deafness is a single gene specific point mutations, with assisted reproductive technology (in vitro fertilization, IVF) of preimplantation genetic diagnosis (preimplantation genetic diagnosis, PGD) medical indications, can effectively avoid the traditional mid pregnancy abortion treatment of abnormal embryos on patients and their family physical and psychological harm caused by the subject. Dr. Zhu Yuhua group in the previous study, an autosomal dominant non syndromic deafness pedigree of DFNA64 DIABLO gene were identified in the probands of couples in understanding the genetic diagnosis technology of embryo implantation (PGD) can prevent deaf children after birth, have a strong desire for the study. And signed informed consent.
Single cell nested PCR by single blastomere of the proband were single lymphocytes and others discarded embryos, whole genome in a single cell multiple displacement amplification (MDA) and subsequent PCR sequencing and linkage analysis markers real-time fluorescence quantitative PCR and microsatellite, established the technical system of preimplantation genetic deafness gene diagnosis. The research group and Beijing Medical University Third hospital assisted reproductive center Professor Liu Ping cooperation, the couple made a complete PGD assisted reproductive clinical diagnosis and treatment process, the diagnosis of a healthy embryo and implanted into the womb, but did not get a successful pregnancy.
The second part is the research orientation of non syndromic hereditary deafness pedigree
By the analysis of phenotypic and genetic methods, SD-L030 pedigrees collected to determine autosomal dominant non syndromic deafness family. Using microsatellite STR as genetic marker and classical linkage analysis of the family, the location of deafness gene, screening and identification of.SD-L030 family, a total of 4 generations members, a total of 30 people (including the deceased and spouse) is an autosomal dominant hereditary deafness pedigrees. Application of microsatellite markers was screened on 23 known DFNA loci, the family deafness gene located between 7p15 D7S629-D7S516 about 1.87cM area overlap with the known deafness gene DFNA5 region. Direct sequencing in the seventh intron of DFNA5 gene in the identification of a novel mutation of DFNA5, IVS7-2AG, and the mutation in this family phenotype were separated by extraction of peripheral blood mRNA and RT-PCR, found the point mutation In DFNA5 exon eighth deletion transcription.
Study on the syndrome of pathogenic gene screening and molecular mechanism of comprehensive third part of Treacher Collins
Treacher Collins syndrome (Treacher Collins, syndrome, TCS) is a common genetic disease, the incidence rate of 1/50000, mainly for the development of bilateral malar bone structure caused by abnormal craniofacial hypoplasia. In this study, two cases of suspected TCS were studied by direct sequencing of TCOF1 gene of second patients with TCOF1 exon c.146 TC heterozygous mutation, the mutation site of forty-ninth encoding isoleucine to threonine substitution, the father, the mother of the mutation site mutation was found, the mutation is a new mutation. The research results provide information and basis for the demand for genetic counseling and prenatal diagnosis of the family is the next step. At the same time, research progress on the molecular pathogenesis of TCS and the pathogenic mechanism of genes were analyzed and summarized in detail.

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R764.43

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本文編號：1716577