本文選題：抗炎作用　切入點(diǎn)：內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎（EIU）　出處：《上海交通大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的： 多肽H-RN是來源于肝細(xì)胞生長因子Kringle1結(jié)構(gòu)域的一個(gè)由11個(gè)氨基酸組成的肽段，其序列為RNPRGEEGGPW，我們在前面的研究中已經(jīng)證實(shí)其具有體內(nèi)外抗新生血管活性。本研究旨在對抗新生血管性多肽H-RN的抗炎效果進(jìn)行系統(tǒng)性的研究和評價(jià)，并初步探究其抗炎機(jī)制研究。 方法： 1、多肽H-RN的體外抗炎有效性研究 通過脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW264.7來建立體外炎癥模型，經(jīng)多肽H-RN及其他藥物處理，在進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)的基礎(chǔ)上檢測炎性因子腫瘤壞死因子（TNF）-α和白介素（IL）-6的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平的變化，并采用Transwell趨化實(shí)驗(yàn)研究H-RN對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞趨化作用的影響。 由TNF-α刺激誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）構(gòu)建炎癥模型，通過共聚焦顯微鏡觀察H-RN對內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附過程的影響，并檢測TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞分泌粘附分子水平的變化。 2、多肽H-RN的體內(nèi)抗炎有效性研究 采用LPS單次足墊注射法來構(gòu)建大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎（EIU）模型，通過單次玻璃體腔內(nèi)給藥對EIU大鼠以多肽H-RN或其他藥物治療，24小時(shí)后進(jìn)行臨床癥狀評分、房水中炎性細(xì)胞因子計(jì)數(shù)、蛋白定量、TNF-α和IL-6水平檢測以及病理組織學(xué)評價(jià)。 通過對Lewis大鼠皮下注射包含視網(wǎng)膜抗體R16的誘導(dǎo)劑免疫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型，在免疫后第6，9，12天，分別予以H-RN或其他藥物玻璃體腔內(nèi)注射治療。免疫后的每天均對大鼠臨床表現(xiàn)進(jìn)行評分，在免疫后第14天取房水和眼內(nèi)組織進(jìn)行炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平檢測，并在第16天進(jìn)行組織病理學(xué)評分。 3、多肽H-RN的抗炎作用機(jī)制研究 通過異硫氰酸熒光素（FITC）熒光標(biāo)記多肽H-RN，在共聚焦顯微鏡下觀測熒光多肽在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)；應(yīng)用免疫熒光手段檢測H-RN對LPS誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響；并運(yùn)用Western blot方法定量檢測LPS誘導(dǎo)的NF-κB及其上游信號通路的PI3K-p85、AKT和IKK等因子的磷酸化水平變化。 結(jié)果： 1、多肽H-RN在體外的抗炎作用 多肽H-RN及隨機(jī)序列雜肽H-GP在濃度為50-500μM時(shí)均對RAW264.7和HUVEC細(xì)胞增殖活性沒有影響。LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6含量顯著增高，而多肽H-RN在治療濃度為100μM及以上時(shí)可在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平顯著抑制炎癥因子的含量，且表現(xiàn)出劑量依賴性，同時(shí)還可明顯抑制LPS作為趨化因子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移活動。 另外，多肽H-RN在治療濃度為100μM及以上時(shí)可顯著減少由TNF-α誘導(dǎo)的單核細(xì)胞U937和內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的粘附，并抑制粘附分子包括ICAM-1, VCAM-1和E-selectin的表達(dá)水平。 2、多肽H-RN的體內(nèi)抗炎作用 多肽H-RN單次玻璃體腔內(nèi)注射可以顯著改善EIU臨床表現(xiàn)評分，且有效抑制房水中炎性細(xì)胞和蛋白質(zhì)的滲出并降低房水中TNF-α和IL-6的水平，在病理組織學(xué)方面也明顯減輕了虹膜睫狀體以及玻璃體視網(wǎng)膜的炎性細(xì)胞浸潤。 在EAU方面，自免疫后第6天起每三天一次玻璃體腔注射多肽H-RN，EAU的臨床評分自第11天起顯著降低；而眼內(nèi)組織勻漿中IL-6的水平和房水中及組織勻漿中的IFN-γ的水平也得到明顯的抑制；在組織病理切片中，多肽治療組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的破壞明顯減輕，眼球后節(jié)浸潤的炎癥細(xì)胞顯著減少。 3、多肽H-RN的抗炎作用機(jī)制 多肽H-RN通過吞噬泡樣的結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并抑制LPS誘導(dǎo)的PI3K p85亞基和AKT的磷酸化，從而抑制IKK復(fù)合物的活化，減少IκB的降解，，抑制NF-κB的激活；免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示H-RN可抑制p65尤其是磷酸化的pp65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。 結(jié)論： 1、體外有效性方面：多肽H-RN在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平水平降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子的含量，并抑制細(xì)胞向LPS趨化遷移；同時(shí)，多肽H-RN可抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC粘附分子的水平，并阻止單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附。 2、體外有效性方面：多肽H-RN玻璃體腔內(nèi)給藥在臨床癥狀、炎癥因子和蛋白滲出以及組織病理學(xué)改變等方面對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎（EIU）和自身免疫性葡萄膜炎（EAU）均具有一定的療效。 3、機(jī)制研究方面：多肽H-RN抗炎作用的實(shí)現(xiàn)與PI3K-AKT-IKK-IκBα-NF-κB信號通路有關(guān)。
[Abstract]:Objective:
H-RN is a polypeptide derived from hepatocyte growth factor Kringle1 domain consists of a 11 amino acid peptide, the sequence of RNPRGEEGGPW, we have shown in the previous study of its antiangiogenic activity in vitro and in vivo. Research and evaluation system of the anti-inflammatory effect of this study is to against neovascular polypeptide H-RN the research, and to explore its anti inflammation mechanism.
Method錛

本文編號：1701376