本文選題：Evi1　切入點(diǎn)：miR-33　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:鼻咽癌是我國(guó)南方部分省份最為常見的腫瘤之一,其發(fā)病率約為每10萬人25～50例,是西方國(guó)家的50-100倍。先前的研究表明鼻咽癌的發(fā)生與遺傳因素、EBV感染以及環(huán)境因素相關(guān),有較為顯著的家族聚集傾向性�；颊呋蚪M多存在不穩(wěn)定性,易受各種環(huán)境因素的影響。EB病毒研究顯示,在鼻咽癌患者的血清中,抗EB病毒抗體的種類和含量均高于一般人�？梢�,EB病毒與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有著極其密切的關(guān)系。Evi1(Ecotropic viral integration site 1)基因是作為逆病毒的整合位點(diǎn),在患髓細(xì)胞樣白血病的老鼠中被發(fā)現(xiàn)和鑒定,逆病毒的整合使Evi1活化從而導(dǎo)致髓細(xì)胞樣白血病的發(fā)生[1]。在人類,由于染色體t(3;21)(q26;q22)的移位或inv[2](q21q26)的倒位所致Evi1異常表達(dá)被認(rèn)為與慢性髓細(xì)胞樣白血病(CML)、急性髓細(xì)胞樣白血病(AML)的發(fā)生相關(guān),Evi1的持續(xù)高表達(dá)也被公認(rèn)為AML的不良預(yù)后指標(biāo)[3]。此外在卵巢癌[3]、結(jié)腸癌[4]和肺癌[5]等實(shí)體癌中也發(fā)現(xiàn)Evi1高表達(dá)。這些證據(jù)表明Evi1在腫瘤的起始和進(jìn)展中起到極為重要的作用。Evi1的腫瘤促進(jìn)作用是通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn),Evi1直接與TGF-β的效應(yīng)分子Smad3相結(jié)合而阻斷TGF-β信號(hào)的傳遞[6,7],或者通過與CtBP(C末端結(jié)合蛋白)相結(jié)合來抑制Smad3的功能[8]。Evi1通過兩段5氨基酸序列(PFDLD......PLDLS)與CtBP結(jié)合,CtBP然后把Smad3從一個(gè)對(duì)TGF-β反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄活化子轉(zhuǎn)換成一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子[8,9]。EBNA3A是EBV對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需的五個(gè)基因之一[10,11],也是通過與CtBP相結(jié)合來促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[12]。值得指出的是,EBNA3A是通過與Evi1五氨基酸序列類似的位點(diǎn)而與CtBP結(jié)合。這一現(xiàn)象提示,Evi1可能在功能上與EBNA3A重疊,并與鼻咽癌的發(fā)病有關(guān)。在前期實(shí)驗(yàn)中,我們采用微陣列比較基因組技術(shù),發(fā)現(xiàn)位于3q26區(qū)的瘤基因Evi1和PKC(?)在鼻咽癌中共擴(kuò)增。隨之發(fā)現(xiàn)Evi1在大多數(shù)鼻咽癌細(xì)胞系和原發(fā)性鼻咽癌組織中均有較強(qiáng)表達(dá)。采用慢病毒shEvi1感染Evi1高表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞,沉默Evi1蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞體外增殖顯著減緩,裸鼠體內(nèi)致瘤性顯著降低。TP53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因,約有50%以上的腫瘤患者被發(fā)現(xiàn)有TP53基因突變,約有70%-80%的肺癌患者發(fā)現(xiàn)有TP53基因突變,而且TP53基因突變?cè)谀[瘤發(fā)生中是早期事件,可應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[13]。TP53基因位于人染色體17q13.1區(qū)帶,編碼的野生型p53蛋白包含N-末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四聚體化結(jié)構(gòu)域和C-末端調(diào)節(jié)域[14]。p73、p51、p63等基因由于在結(jié)構(gòu)上與TP53基因具有同源性,因而被歸為TP53基因家族[15]。TP53基因與其上、下游功能相關(guān)基因組成了一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò),是聯(lián)系不同遺傳應(yīng)急和細(xì)胞應(yīng)答的中間環(huán)節(jié)。離子輻射、化療藥物及異常的細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)均能刺激TP53基因表達(dá)[16]。p53表達(dá)升高后,可通過p53-MDM2環(huán)路對(duì)p53表達(dá)水平進(jìn)行精確調(diào)節(jié)。p53可以調(diào)控下游多種基因表達(dá),其功能主要表現(xiàn)在阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性和抑制腫瘤血管生成四個(gè)方面[17,18]。microRNA是一種調(diào)節(jié)性的非編碼小分子RNA,其在生命活動(dòng)中起著重要的作用。microRNA 一般作用于靶標(biāo)分子mRNA的非編碼區(qū),通過不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式抑制靶標(biāo)mRNA的翻譯,從而對(duì)靶標(biāo)基因在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控[19]。研究發(fā)現(xiàn),miR-33與多種腫瘤發(fā)生有關(guān),miR-33能特異性結(jié)合于p53 mRNA的3'-UTR區(qū),抑制p53表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[20]。在本研究中我們采用一系列分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),首次證明了 Evi1通過miR-33下調(diào)p53蛋白表達(dá)水平,影響其下游信號(hào)通路,進(jìn)而影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及致瘤性。研究?jī)?nèi)容及方法:一、Evi1通過miR-33對(duì)p53進(jìn)行調(diào)節(jié)(一)Evi1基因?qū)53表達(dá)的抑制作用1.采用免疫組化檢測(cè)Evi1和p53在鼻咽癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。2.采用Westen Blot方法,檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株SUNE1、CNE1、CNE2、HONE1、6-10B、5-8F以及永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69中Evi1和p53的表達(dá)水平。3.合成siEvi1,轉(zhuǎn)染HONE1細(xì)胞,沉默Evi1。4.構(gòu)建pWPI-Evi1慢病毒過表達(dá)載體,包裝慢病毒感染鼻咽癌細(xì)胞6-10B,過表達(dá)Evi1。5.采用Westen Blot方法,檢測(cè)在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中過表達(dá)Evi1后,p53的表達(dá)水平。6.采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù),檢測(cè)Evi1和p53在HONE1和NP69中的表達(dá)水平和定位以及在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中的表達(dá)水平和定位。(二)Evi1對(duì)p53的調(diào)節(jié)作用1.采用Westen Blot方法,分別在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中過表達(dá)Evi1,檢測(cè)p53表達(dá)水平的變化。2.采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù),檢測(cè)在HONE1細(xì)胞中沉默Evi1后p53的表達(dá)水平和定位。(三)miR-33對(duì)p53的調(diào)節(jié)作用分別在HONE1和6-10B細(xì)胞中過表達(dá)和抑制miR-33,通過western blot檢測(cè)p53表達(dá)水平的變化。(四)Evi1對(duì)miR-33的調(diào)節(jié)作用1.分別在HONE1中沉默Evi1和在6-10B細(xì)胞中過表達(dá)Evi1,采用RT-PCR技術(shù),檢測(cè)miR-33的變化情況。2.構(gòu)建pGL4.51-miR-33promotor熒光素酶報(bào)告載體,與pcDNA-Evi1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,檢測(cè)Evi1基因?qū)iR-33 promotor的調(diào)控作用。3.構(gòu)建PGL4.51-miR-33 promotor點(diǎn)突變熒光素酶報(bào)告載體,明確miR-33 promotor區(qū)的Evi1調(diào)節(jié)位點(diǎn)。(五)Evi1通過miR-33對(duì)TP53基因表達(dá)的調(diào)控作用1.采用Westen Blot方法,分別在HONE1細(xì)胞中沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33和在6-10B細(xì)胞中過表達(dá)Evi 1的同時(shí)抑制miR-33,檢測(cè)p53表達(dá)水平的變化。2.采用免疫熒光技術(shù),檢測(cè)p53在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1中的表達(dá)情況。二、在鼻咽癌細(xì)胞中Evi1通過miR-33調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和凋亡。(一)Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用1.以siEvi1序列為基礎(chǔ)構(gòu)建shEvi1,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HONE1和6-10B細(xì)胞,沉默Evi1。2.采用MTT方法,檢測(cè)沉默Evi1的HONE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞以及過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞和過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞的6天生長(zhǎng)曲線。3.采用EdU方法,檢測(cè)沉默Evi1的HOE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞以及過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞和過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞的EdU的吸收水平。4.采用平板克隆實(shí)驗(yàn),檢測(cè)沉默Evi1的HONE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞以及過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞和過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞的平板克隆形成率及形成克隆大小。(二)Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的調(diào)節(jié)作用采用western blot方法,檢測(cè)在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞以及過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞和過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞中,p21和MDM2的表達(dá)水平。(三)Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用1.采用western blot方法,檢測(cè)在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞以及過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞和過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞中,Bax和Survivin的表達(dá)水平。2.采用流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)方法,檢測(cè)沉默Evi1的HONE1細(xì)胞和沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞以及過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞和過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞的凋亡比例。(四)采用western blot方法,檢測(cè)Evi1對(duì)由化療藥物(阿霉素)誘導(dǎo)的p53蛋白水平上調(diào)的拮抗作用。(五)采用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),檢測(cè)沉默Evi1的HONE1細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。對(duì)瘤體做western blot檢測(cè),再次檢驗(yàn)Evi1和p53的表達(dá)水平。三、Evi1的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用1.用pWPI-Evi1感染小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3和永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69,穩(wěn)定過表達(dá)Evi1。2.采用轉(zhuǎn)化灶形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過表達(dá)Evi1的NIH3T3細(xì)胞和NP69細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化灶的能力。3.采用軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過表達(dá)Evi1的NIH3T3細(xì)胞和NP69細(xì)胞在軟瓊脂中形成克隆的能力。4.采用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過表達(dá)Evi1的NIH3T3細(xì)胞和NP69細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。RT-PCR實(shí)驗(yàn)采用單樣本t檢驗(yàn),熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差分析顯著時(shí),分別采用Bonferroni和Dunnett法進(jìn)行多個(gè)處理組相互比較以及多個(gè)處理組和一個(gè)對(duì)照組的多重比較。EdU實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析,方差分析顯著時(shí),采用Bonferroni法進(jìn)行多重比較。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:一、Evi1通過miR-33對(duì)p53進(jìn)行調(diào)節(jié)(一)Evi1對(duì)p53表達(dá)的抑制作用1.采用免疫組化檢測(cè)Evi1和p53在鼻咽癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。免疫組化檢測(cè)鼻咽標(biāo)本顯示,在50例鼻咽癌標(biāo)本中,有35例呈Evi1高表達(dá),其中29例呈p53表達(dá)陰性,6例呈p53表達(dá)陽(yáng)性;15例Evi1低表達(dá)的標(biāo)本中10例呈p53表達(dá)陽(yáng)性,5例呈p53表達(dá)陰性。2.采用Westen blot方法檢測(cè)Evi1在鼻咽癌細(xì)胞株及永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示Evi1在鼻咽癌細(xì)胞株SUNE1,CNE1,HONE1,5-8F中呈高表達(dá),在CNE2、6-10B細(xì)胞和永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69中呈低表達(dá);p53在NP69中顯著高表達(dá),在鼻咽癌細(xì)胞5-8F中呈高表達(dá),6-10B中呈中高表達(dá),在CNE1,CNE2,HONE1,SUNE1 中呈中低表達(dá)。3.在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中過表達(dá)Evi1后,Western blot結(jié)果顯示,沉默Evi1使p53在HONE1細(xì)胞中表達(dá)升高;過表達(dá)Evi1則使p53在6-10B細(xì)胞中表達(dá)降低。4.免疫熒光結(jié)果顯示,Evi1在HONE1中高表達(dá),在NP69中低表達(dá),定位于細(xì)胞核;p53在HONE1中低表達(dá),在NP69中高表達(dá),亦定位于細(xì)胞核。在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中,p53表達(dá)增強(qiáng)。p53在HONE1的兩個(gè)處理組中均主要呈核表達(dá)。(二)Evi1對(duì)p53的調(diào)節(jié)作用1.采用Westen Blot方法,分別在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中過表達(dá)Evi1,檢測(cè)p53表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中,p53表達(dá)升高;在過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞中,p53表達(dá)降低。2.采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù),檢測(cè)在HONE1細(xì)胞中沉默Evi1后p53的表達(dá)水平和定位。結(jié)果顯示,沉默Evi1后,p53在HONE1細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高。(三)miR-33對(duì)p53表達(dá)的抑制作用在HONE1和6-10B細(xì)胞中分別過表達(dá)和抑制miR-33后,通過western blot檢測(cè)p53的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在HONE1細(xì)胞中,過表達(dá)miR-33,p53表達(dá)略降低,抑制miR-33,p53表達(dá)升高;在6-10B細(xì)胞中過表達(dá)miR-33,p53表達(dá)降低,抑制miR-33,p53表達(dá)升高。(四)Evi1對(duì)miR-33的促進(jìn)作用1.采用RT-PCR技術(shù),分別在HONE1中沉默Evi1以及在6-10B中過表達(dá)Evi1后,檢測(cè)miR-33的變化情況。結(jié)果顯示,miR-33在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中擴(kuò)增量減低(tHONE1=-43.862,PHONEI=0.001);在過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞中,擴(kuò)增量升高(t6-1OB=1 72.730,P6-1OB=0.000)。2.構(gòu)建兩組pGL4.51-miR-33 promotor熒光素酶報(bào)告載體(pGL4.51-miR-33 promotor upstream,pGL4.51-miR-33 promotor downstream),分另與pcDNA3-Evi1表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,檢測(cè)Evi1對(duì)miR-33 promotor的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,與pcDNA3-Evi 1共轉(zhuǎn)染的兩組293T細(xì)胞熒光素酶活性均比與pcDNA3共轉(zhuǎn)染的對(duì)照組有不同程度升高(tup=-18.464,Pup=0.003;tdown=-7.557,Pdown=0.017)。3.構(gòu)建五組pGL4.51-miR-33 promotor點(diǎn)突變熒光素酶報(bào)告載體,明確miR-33 promotor區(qū)的Evi1調(diào)節(jié)位點(diǎn)。結(jié)果顯示,分別點(diǎn)突變可能受Evi1調(diào)節(jié)的五個(gè)miR-33 promotor位點(diǎn),其中上游-2378和下游+183兩處調(diào)節(jié)位點(diǎn)突變后,熒光素酶活性較未突變的對(duì)照組顯著降低(Fup=220.621,Pup=0.000;Fdown=98.451,Pdowen=0.000)。(五)Evi1通過上調(diào)miR-33抑制p53的表達(dá)1.WestenBlot結(jié)果顯示,在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中,p53表達(dá)升高,在沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞中,p53表達(dá)的升高趨勢(shì)被部分抑制,但較對(duì)照組仍略有升高,在過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞中,p53表達(dá)降低,在過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞中,p53表達(dá)的降低趨勢(shì)被部分回調(diào),但較對(duì)照組仍略有降低。2.免疫熒光結(jié)果顯示,在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中,p53表達(dá)升高。在沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞中,p53表達(dá)無顯著升高。二、在鼻咽癌細(xì)胞中Evi1通過miR-33調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、周期和凋亡。本部分選取鼻咽癌細(xì)胞HONE1和6-10B作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。(一)Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默Evi1的HONE1細(xì)胞生長(zhǎng)速度較對(duì)照組顯著減緩,沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞生長(zhǎng)速度較單獨(dú)沉默Evi1組加快,但較對(duì)照組仍減緩;過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞生長(zhǎng)速度較對(duì)照組顯著加快,過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞生長(zhǎng)速度較單獨(dú)過表達(dá)Evi1組減緩,但較對(duì)照組仍加快。2.EdU吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默Evi1的HONE1細(xì)胞EdU吸收水平較對(duì)照組顯著降低,沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞EdU吸收水平較單獨(dú)沉默Evi1組增高,但仍較對(duì)照組降低(F=26.558,P=0.001);過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞EdU吸收水平較對(duì)照組顯著增高,過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞EdU吸收水平較單獨(dú)過表達(dá)Evi1組降低,但仍較對(duì)照組增高(F=33.134,P=0.001)。3.平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沉默Evi1的HONE1細(xì)胞形成克隆速度,克隆大小均較對(duì)照組顯著減低,沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞形成克隆速度,克隆大小均較單獨(dú)沉默Evi1組增高,但仍較對(duì)照組減低(F=180.399,P=0.000);過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞形成克隆速度,克隆大小較對(duì)照組顯著增高,過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞形成克隆速度,克隆大小較單獨(dú)過表達(dá)Evi1組減低,但仍較對(duì)照組增高(F=244.169,P=0.000)。(二)Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的調(diào)節(jié)作用p21和MDM2是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要因子,Western blot結(jié)果顯示,它們?cè)趦煞N細(xì)胞各組中的表達(dá)水平與p53基本一致。在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中,表達(dá)升高,在沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞中,表達(dá)較單獨(dú)沉默Evi1組降低,但仍較對(duì)照組略增加;在過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞中,表達(dá)水平降低,在過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞中,表達(dá)水平較單獨(dú)過表達(dá)Evi1組升高,但仍較對(duì)照組略降低。(三)Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用1.Western b1ot結(jié)果顯示,Bax的表達(dá)水平在兩種細(xì)胞各組中的變化趨勢(shì)與p53基本一致。而Survivin的表達(dá)水平與p53相反,在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞中,表達(dá)水平降低,在沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞中,表達(dá)水平較單獨(dú)沉默Evi1組升高,但仍較對(duì)照組略降低;在過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞中,表達(dá)水平升高,在過表達(dá)Evi1的同時(shí)抑制miR-33的6-10B細(xì)胞中,表達(dá)水平較單獨(dú)過表達(dá)Evi1組降低,但仍較對(duì)照組略升高。2.流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,沉默Evi1的HONE1細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組增加,沉默Evi1的同時(shí)上調(diào)miR-33的HONE1細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞較單獨(dú)沉默Evi1的HONE1細(xì)胞組降低,較對(duì)照組略增加。過表達(dá)Evi1的6-10B細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組減少,過表達(dá)Evi1的同時(shí)下調(diào)miR-33的6-10B細(xì)胞凋亡細(xì)胞較單獨(dú)沉默Evi1的HONE1細(xì)胞組增加,較對(duì)照組略減低。(四)采用western b1ot方法,檢測(cè)Evi1對(duì)由阿霉素(Doxorubicin)誘導(dǎo)的p53蛋白水平上調(diào)的拮抗作用。結(jié)果顯示,阿霉素可誘導(dǎo)p53表達(dá),并呈時(shí)間依賴性,該作用可被Evi1部分拮抗。(五)采用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),檢測(cè)沉默Evi1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響。結(jié)果顯示,沉默Evi1的HONE1細(xì)胞于接種后第10天開始形成腫瘤,對(duì)照組于接種后第6日開始成瘤。至第四周末觀察截止時(shí),沉默Evi1的HONE1細(xì)胞所成腫瘤體積顯著小于對(duì)照組。Western blot結(jié)果顯示,在沉默Evi1的HONE1細(xì)胞形成的腫瘤組織中,Evi1仍較對(duì)照組降低,p53仍較對(duì)照組增高。三、Evi1的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用1.采用轉(zhuǎn)化灶形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過表達(dá)Evi1的NIH3T3和NP69細(xì)胞形成轉(zhuǎn)化灶的能力。在NIH3T3細(xì)胞中過表達(dá)Evi1可在三周內(nèi)平均形成1-3個(gè)轉(zhuǎn)化灶/孔(24孔板),對(duì)照組無轉(zhuǎn)化灶形成。在NP69中過表達(dá)Evi1的及其對(duì)照組細(xì)胞在三周內(nèi)均無轉(zhuǎn)化灶形成。2.采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過表達(dá)Evi1的NIH3T3和NP69細(xì)胞在軟瓊脂中形成克隆的能力。在NIH3T3細(xì)胞中過表達(dá)Evi1在三周內(nèi)形成6-8個(gè)克隆/孔(12孔板),對(duì)照組形成2-3克隆/孔,兩組克隆大小無顯著差異。在NP69中過表達(dá)Evi1在三周內(nèi)形成1-2個(gè)克隆/孔(12孔板),對(duì)照組無克隆形成。3.采用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn),檢測(cè)過表達(dá)Evi1的NIH3T3的體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果顯示,至第八周末停止觀察時(shí),NIH3T3細(xì)胞的處理組和對(duì)照組均無腫瘤形成。結(jié)論1.Evi1通過上調(diào)miR-33抑制p53表達(dá)。2.沉默Evi1在鼻咽癌細(xì)胞中部分通過促進(jìn)p53信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。3.Evi1可部分拮抗由DNA損傷藥物誘導(dǎo)的p53蛋白水平上調(diào)。本研究創(chuàng)新之處1.第一次證明Evi1通過miR-33對(duì)p53進(jìn)行調(diào)節(jié)。2.第一次證明Evi1通過p53信號(hào)通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。3.第一次證明Evi1可部分拮抗由DNA損傷藥物誘導(dǎo)的p53蛋白水平上調(diào)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李振梅;褚福祿;劉穎;王志玉;;風(fēng)疹病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2013年05期

2 姜孟孟;高麗;靖_g;丁一;徐媛媛;周敏航;馬超;王楠;王蔚;韓曉萍;李紅華;王全順;王莉莉;于力;;成人急性髓系白血病患者AML1融合基因的快速檢測(cè)及其臨床意義(英文)[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2013年04期

3 沈露俊;李博斐;洪少東;李長(zhǎng)川;;microRNA與鼻咽癌[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2011年29期

4 黃偉;孫巖;韓瑞發(fā);;MicroRNA與癌癥的研究進(jìn)展[J];天津醫(yī)藥;2009年03期

5 成秀梅;;腫瘤抑制基因p53的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代診斷與治療;2008年03期

，

本文編號(hào)：1684855