本文關鍵詞：17-β雌二醇在TAO成纖維細胞氧化應激中的保護作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第二軍醫(yī)大學》 2013年

17-β雌二醇在TAO成纖維細胞氧化應激中的保護作用研究

明健  

【摘要】：研究背景： 甲狀腺相關性眼病（Thyroid‐associated Ophthalmopathy，TAO）是最常見的眼眶疾病，在歐美國家中，TAO的發(fā)病率男、女分別為16/10萬和3/10萬，目前國內的發(fā)病率尚無明確數據，但據國內的一些城市的流行病學調查表明，隨我國食鹽中含碘量的增加，甲狀腺功能亢進(簡稱甲亢)發(fā)病率出現上升趨勢，而甲亢是導致TAO最主要的因素，其中大約25%‐50%的甲亢患者會出現TAO。由此可見，TAO的發(fā)病率也有逐年增高。TAO是一組非常復雜的眼眶病，輕者可以導致眼球突出、眼瞼閉合不全，從而影響患者外觀；重者可以導致復視、視力下降甚至失明。然而TAO的病因尚不明確，其主要治療方案目前也只是局限于對癥治療，如激素沖擊療法、復視矯正術、提上瞼肌延長術和眼眶減壓術等。況且大部分患者以眼球突出就診，就診時往往已經有很明顯的眼部癥狀，常規(guī)給予激素沖擊治療的完全治愈率幾乎為0%，治療后易出現反復復發(fā)，這些都嚴重的影響了TAO患者的生活質量。 自Wilson首次發(fā)現在Grave’s病患者中有氧化自由基的活性增加以及抗氧化活性的減少以來，氧化應激開始進入Grave’s病研究者的視野中，氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用的失衡，，傾向于氧化。目前越來越多的基礎和臨床研究證據證明氧化應激的代謝參與了甲狀腺相關眼病的自身免疫的病理發(fā)病過程。因此，人們開始探索安全有效的甲狀腺相關眼病的抗氧化治療方法，但目前抗氧化治療方面的研究較少，抗氧化藥物也多為口服，作用緩慢。最近一些氧化應激參與的疾病如阿爾茨海默病、糖尿病、動脈樣硬化等疾病的研究中發(fā)現，17‐β雌二醇能有效抑制相關疾病中的氧化應激水平，且副作用小，可局部注射或經皮局部給藥。因此我們則致力于探索17‐β雌二醇在甲狀腺相關眼病成纖維細胞中氧化應激損傷方面的作用，希望能為甲狀腺相關眼病探索出一條安全、有效、易普及的抗氧化治療方案。 本課題擬采用過氧化氫(H2O2)作用于甲狀腺相關性眼病患者眼外肌來源成纖維細胞(orbital fibroblasts，OF)，制備外源性氧化應激細胞模型，探索17β-雌二醇（E2）在TAO成纖維細胞氧化應激過程中的保護作用。實驗共分為兩部分：第一部分，建立TAO成纖維細胞外源性氧化應激細胞模型，利用MTT法明確干預成纖維細胞的H2O2的濃度，并且明確17-β雌二醇的對TAO成纖維細胞增殖是否有影響，為后期17-β雌二醇干預后氧化應激相關指標的檢測做準備；第二部分，研究不同濃度的17-β雌二醇干預成纖維細胞外源性氧化應激細胞模型后抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質氧化損傷產物MDA的水平，分析17-β雌二醇的濃度與抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質氧化損傷產物MDA的水平的關系。 第一部分：TAO成纖維細胞外源性氧化應激細胞模型的建立 目的:采用H2O2干預TAO成纖維細胞，建立TAO成纖維細胞的外源性氧化應激細胞模型，為下一步不同濃度17-β雌二醇的干預此細胞模型后CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質氧化損傷產物MDA的檢測做準備。 方法：眼眶成纖維細胞培養(yǎng)來源于TAO限制性斜視矯正術及嚴重性TAO行眼眶減壓術取下的眼外肌，采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)TAO眼眶成纖維細胞，采用MTT法確定TAO成纖維細胞亞致死劑量的H2O2濃度作為TAO成纖維細胞的干預濃度。此外，繼續(xù)采用MTT法觀察17-β雌二醇對TAO成纖維細胞增殖的影響。 結果：（1）數據被表示為四個獨立實驗的結果的平均值±SD。H2O2干預組與空白對照組的細胞成活率在H2O2濃度為60μmol/L的差異是有統(tǒng)計學意義的（76.8%，P=0.003＜0.05），而在40μmol/L時無明顯差異（87.4％，P=0.104）。（2）17-β雌二醇干預24h后，結果顯示17-β雌二醇干預組與空白組在細胞數量上無明顯差異。結論：（1）將40μmol/L作為制備外源性氧化細胞模型H2O2的干預濃度。（2）17-β雌二醇干預24h對TAO成纖維細胞的增殖無明顯影響。 第二部分：不同濃度的17-β雌二醇干預成纖維細胞外源性氧化應激細胞模型后抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質氧化損傷產物MDA的水平的檢測 目的:研究不同濃度的17-β雌二醇干預外源性氧化應激細胞模型后，檢測其抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質氧化損傷產物MDA的水平，以明確17-β雌二醇的抗氧化作用。 方法：將TAO患者來源的成纖維細胞隨機分為6組培養(yǎng):A組(空白組：無17-β雌二醇、無H2O2)、B組(單純40μmol/L H2O2刺激組)、C組(40μmol/L H2O2+2.5nmol/L17-β雌二醇)、D組(40μmol/L H2O2+5nmol/L17-β雌二醇)及E組（40μmol/L H2O2+10nmol/L17-β雌二醇）。17-β雌二醇干預組在加入H2O2前先加入17-β雌二醇預處理，并放于含體積分數5%CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱孵育24h，之后H2O2干預90min后，檢測各組過氧化氫酶（CAT）和超氧化岐物酶（SOD）的活性、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的水平。 結果：（1）17-β雌二醇對TAO成纖維細胞氧化應激過程中抗氧化體系（SOD、CAT和GSH/GSSH）的影響：H2O2處理1.5h后,除了C組的GSH/GSSH，17-β雌二醇預處理組（C、D、E組）與單純H2O2組（B組）在SOD、CAT、GSH/GSSH和MDA水平差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)，且隨著17-β雌二醇濃度的增加，各抗氧化酶活性也隨之增加。而17-β雌二醇干預組（C、D、E組）與空白對照組（A組）在SOD、CAT、GSH/GSSH和MDA水平差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；（2）17-β雌二醇對TAO成纖維細胞氧化應激過程中脂質氧化產物MDA的影響：H2O2干預后，各組的MDA含量較空白對照組均顯著增多（P＜0.05），且隨著預干預的17β雌二醇的濃度越小，MDA的含量越高，單純H2O2干預組的MDA含量最高，且與17-β雌二醇干預的各組的差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：1、雌二醇干預組的抗氧化酶類均比無雌二醇干預組高，且與17-β雌二醇的濃度呈正相關； 2、雌二醇干預組的脂質氧化反應產物MDA較無雌二醇干預組低，且與17-β雌二醇的濃度成負相關。 總之，17-β雌二醇可明顯增高TAO成纖維細胞內抗氧化酶的水平，從而增強其對外源性氧化應激的抗氧化能力，減輕其氧化損傷，且成劑量相關性。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R771.3
【目錄】：

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本文編號：166694