本文選題：間充質(zhì)干細胞　切入點：角膜移植　出處：《天津醫(yī)科大學》2010年碩士論文

【摘要】：目的 角膜移植術(shù)是目前器官和組織移植成功率最高的手術(shù),但術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)仍是手術(shù)失敗的最主要的原因。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)能夠抑制多種免疫細胞(包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞以及樹突狀細胞)的增殖和功能。本研究采用MSCs和／或環(huán)孢霉素A(cyclosporin A,CsA)治療大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng),檢測MSCs在角膜移植大鼠體內(nèi)能否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,以及其可能的作用機制,試圖建立MSCs移植治療角膜移植排斥反應(yīng)的技術(shù)平臺。 方法 1.原代培養(yǎng)Lewis或Wistar大鼠MSCs,達90%融合時傳代培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測培養(yǎng)細胞的表型,并做體外誘導分化實驗,以備后續(xù)實驗使用。 2.制作大鼠角膜移植動物模型,隨機分為6組。A組給予等量不含藥物的PBS,B組術(shù)后肌注CsA,C組術(shù)前尾靜脈注射MSCs,D組術(shù)后尾靜脈注射MSCs,E組術(shù)前注射MSCs+術(shù)后肌注CsA, F組術(shù)后注射MSCs+術(shù)后肌注CsA。裂隙燈下對角膜植片進行臨床觀察,以混濁、水腫和新生血管3項指標作為臨床評估標準,比較6組角膜植片的平均存活時間。術(shù)后10d,A組與D組病理組織學檢查角膜的結(jié)構(gòu)變化。 3.角膜移植模型建立后10天,收集A組與D組大鼠脾臟以及腹股溝淋巴結(jié),分離單個核細胞,在刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA)刺激下孵育72h后,采用BrdU試劑盒檢測各組大鼠免疫應(yīng)答強度。 4.取ConA刺激下A組與D組大鼠脾臟和淋巴結(jié)單個核細胞孵育72h后的上清液,采用ELISA試劑盒檢測Thl類和Th2類細胞因子分泌情況。 5.角膜移植模型建立后10天,取A組和D組大鼠外周血,流式細胞儀測定CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的百分比。 6.角膜移植模型建立后10天,收集A組和D組大鼠脾臟以及淋巴結(jié),分離單個核細胞,提取總RNA,采用RT-PCR測定FOXP3mRNA表達水平。 結(jié)果 1.成功分離并鑒定了MSCs, MSCs呈間質(zhì)細胞特性：梭形,漩渦狀排列。VonKossa染色、油紅染色貼壁細胞呈骨樣細胞及脂肪樣細胞分化。 2.成功建立大鼠角膜移植動物模型。 3.采用MSCs治療角膜移植術(shù)后大鼠,除C組外,B組、D組、E組和F組角膜植片的存活時間與A組相比明顯延長,D組與B組、E組與F組相比有顯著差異,但B組、E組與F組3者之間統(tǒng)計學無顯著性差異(P0.05)。組織學檢查發(fā)現(xiàn)D組角膜植片中炎性細胞和新生血管明顯輕于A組。 4.體外和體內(nèi)T細胞增殖實驗表明,MSCs可以顯著抑制致病性T細胞增殖(P0.05)。 5.ELISA結(jié)果顯示,D組Th1細胞因子分泌顯著降低(P0.05),而Th2細胞因子(IL-4)分泌升高(P0.05),但IL-10分泌兩者無顯著性差異。 6.與對照組相比,D組大鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞比例顯著增高(P0.05),實時定量PCR檢測也發(fā)現(xiàn)FOXP3-mRNA在D組表達量顯著高于對照組(P0.05)。 結(jié)論 MSCs可以通過抑制T細胞免疫應(yīng)答、改變Th1/Th2應(yīng)答平衡以及上調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞,有效預(yù)防并治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)。本研究證實了通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng),MSCs對免疫性疾病具有治療作用。
[Abstract]:objective
Corneal transplantation is currently the highest success rate of organ and tissue transplantation surgery, but postoperative immune rejection is the main reason for the failure of surgery is the reaction. Mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) can inhibit a variety of immune cells (including T lymphocytes, B lymphocytes, NK cells and dendritic cells) the proliferation and function. This research adopts MSCs and / or cyclosporine A (cyclosporin A CsA) on rat corneal allograft rejection, the detection of MSCs in corneal transplantation rats can play a role in immune regulation, and its possible mechanism, trying to establish a technology platform MSCs transplantation for the treatment of corneal allograft rejection.
Method
1. the primary culture of Lewis or Wistar rat MSCs reached 90% fusion and was passaged. The phenotype of cultured cells was detected by flow cytometry, and in vitro induced differentiation experiments were used for subsequent experiments.
2. making rat corneal transplantation animal model, randomly divided into 6 groups:.A group was given the same amount of free drugs, PBS, B group after intramuscular injection of CsA, C group of preoperative intravenous injection of MSCs, group D after intravenous injection of MSCs, E group after injection of MSCs+ after intramuscular injection of CsA, F group after operation injection of MSCs+ after intramuscular injection of CsA. on the slit lamp corneal graft were observed, with opacity, edema and neovascularization of 3 indicators as a standard clinical evaluation, comparison of 6 groups of corneal graft. The mean survival time of postoperative 10d, structural changes of A group and D group histopathological examination of the cornea.
3. days after establishment of corneal transplantation model, mononuclear cells were isolated from spleen and groin lymph nodes of rats in group A and group D, and 72h was incubated under concanavalin A (concanavalin A, ConA) stimulation. Then BrdU test kit was used to detect immune response in each group of rats. A was used to detect the immune response of rats in each group.
4. after ConA stimulation, the supernatant of spleen and lymph node mononuclear cells of A group and D group were incubated with 72h, and the secretion of Thl and Th2 cytokines were detected by ELISA kit.
10 days after the establishment of 5. corneal transplantation models, the peripheral blood of rats in group A and group D was taken, and the percentage of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells was measured by flow cytometry.
6. days after the establishment of corneal transplantation model, the spleen and lymph nodes of rats in group A and D were collected, and the mononuclear cells were isolated. The total RNA was extracted, and the expression level of FOXP3mRNA was detected by RT-PCR. The expression level of FOXP3mRNA was detected by RT-PCR.
Result
1., MSCs and MSCs were successfully isolated and identified, showing interstitial cell characteristics: spindle shape, whirlpool arrangement,.VonKossa staining, and oil red staining adherent cells were differentiated into osteoid cells and fat like cells.
2. the rat model of corneal transplantation was successfully established.
By 3. MSCs after corneal transplantation in rats, except C group, B group, D group, E group and F group of corneal graft survival time was significantly prolonged compared with A group, D group and B group, E group and F groups have significant differences, but in B group, no significant difference statistics between E group and F group 3 (P0.05). Histological findings of D group of corneal inflammatory cells and neovascularization significantly lighter than A group.
4. the proliferation of T cells in vitro and in vivo showed that MSCs could significantly inhibit the proliferation of pathogenetic T cells (P0.05).
5.ELISA results showed that the secretion of Th1 cytokines in the D group decreased significantly (P0.05), while the secretion of Th2 cytokine (IL-4) increased (P0.05), but there was no significant difference between the secretion of IL-10 and the secretion of IL-10.
6. compared with the control group, the percentage of regulatory T cells in the D group increased significantly (P0.05), and the real-time quantitative PCR test also showed that the expression of FOXP3-mRNA in D group was significantly higher than that in the control group (P0.05).
conclusion
MSCs can effectively prevent and treat corneal allograft rejection by inhibiting the T cell immune response, changing the balance of Th1/Th2 response and upregulating regulatory T cells. This study confirms that MSCs plays a therapeutic role in immune diseases by regulating the body's immune system.

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R779.65

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本文編號：1665414