本文選題：Toll樣受體　切入點(diǎn)：脂多糖　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)是最嚴(yán)重的眼部感染性疾病之一,治療不當(dāng)迅速惡化,數(shù)天內(nèi)即可導(dǎo)致失明。誘發(fā)角膜真菌感染首要的原因在發(fā)展中國(guó)家為角膜創(chuàng)傷,在發(fā)達(dá)國(guó)家則為角膜接觸鏡的配戴。濕熱的氣候是所有地區(qū)的高危致病因素。鐮刀菌和曲霉菌是真菌性角膜炎最常見(jiàn)的病原體。正常情況下,角膜對(duì)真菌感染有很強(qiáng)的抵抗力,當(dāng)角膜上皮完整性遭到破壞,暴露其下方角膜基質(zhì)層時(shí),才會(huì)發(fā)生真菌性角膜炎。角膜基質(zhì)細(xì)胞是角膜天然免疫防御體系的第二道屏障,參與真菌的快速識(shí)別、抵抗真菌入侵。 Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)是天然免疫的關(guān)鍵模式識(shí)別受體,通過(guò)識(shí)別微生物的固有成分病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)發(fā)揮重要作用。多種TLRs在角膜基質(zhì)細(xì)胞的胞膜上或胞質(zhì)內(nèi)都有表達(dá),其中TLR4的特異性配體為脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),TLR2則能夠識(shí)別來(lái)源于革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌的多種脂肽和脂蛋白成分。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TLR2及TLR4是角膜啟動(dòng)抗真菌天然免疫的主要受體,在煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus, AF)角膜炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮決定性作用。TLR2、4的活化能激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而介導(dǎo)炎性因子的分泌,趨化炎癥細(xì)胞向角膜基質(zhì)層遷移,同時(shí)誘導(dǎo)抗菌因子產(chǎn)生,殺滅和清除致病原。然而,過(guò)度的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致組織損傷和破壞,誘發(fā)角膜穿孔或視力喪失,TLRs介導(dǎo)的角膜抗真菌免疫反應(yīng)必須控制在適度范圍內(nèi)。 TLRs通過(guò)與接頭蛋白分子髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88, Myd88)和TIR結(jié)構(gòu)域接頭分子(Toll-IL-1receptor domain-containing adaptor inducing interferon-beta, TRIF)結(jié)合激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TLRs的炎癥損傷效應(yīng)主要與Myd88依賴的經(jīng)典途徑和Myd88依賴的促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途徑有關(guān),二者通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1),介導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子,如白介素(interleukin, IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a等的分泌。與之相反,MyD88非依賴的TRIF途徑能激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)-3,從而調(diào)節(jié)干擾素(interferon, IFN)-β和其他抗炎介質(zhì)的表達(dá)。因此,TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中存在著損傷與保護(hù)的微妙平衡,一旦打破將對(duì)角膜抗真菌天然免疫反應(yīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。 我們的前期研究證明,小劑量的LPS預(yù)處理能夠誘導(dǎo)永生化人角膜基質(zhì)細(xì)胞(telomerase-immortalized human stroma fibroblasts, THSFs)再編程,調(diào)控角膜抗煙曲霉菌天然免疫反應(yīng)。小劑量LPS預(yù)處理THSFs一定時(shí)間后再用煙曲霉菌刺激,炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8的分泌量減少,抗菌肽CCL20和Tβ4的表達(dá)增加,多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)的遷移受到抑制。所以,LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程為真菌感染提供了一種保護(hù)性機(jī)制,在避免過(guò)度角膜炎癥反應(yīng)的同時(shí)增強(qiáng)角膜先天抗感染能力。 但是,關(guān)于LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的煙曲霉菌刺激角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程的作用機(jī)制目前尚不明確。我們用小劑量LPS預(yù)處理12h后,再用大劑量煙曲霉菌刺激THSFs,觀察TLR4、TLR2mRNA水平的變化,利用TLR4、2的特異性中和抗體進(jìn)一步明確TLRs在角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程中的作用；繼而研究了LPS預(yù)處理對(duì)TLRs下游Myd88依賴的經(jīng)典途徑、Myd88依賴的MAPK途徑以及MyD88非依賴的TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。探索脂多糖預(yù)處理誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞再編程調(diào)控角膜抗真菌天然免疫的分子機(jī)制,將為合理調(diào)控抗真菌炎癥反應(yīng)、避免角膜組織損傷與破壞以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重建提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。 第一部分TLR4介導(dǎo)LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程 [目的] 研究煙曲霉菌刺激下脂多糖預(yù)處理引起的角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程中的關(guān)鍵受體。 [方法] 1.AF菌種和菌絲的制備：AF菌株CCTCC93024購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將菌種接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,37℃條件下200轉(zhuǎn)每分鐘(revolution per minute, rpm)搖床培養(yǎng)24h。收集孢子以108個(gè)/ml的終濃度接種于沙氏液體培養(yǎng)基,接種的試管26℃、500rpm搖床培養(yǎng)18h后1000×g離心10min。得到的AF菌絲體漂洗2次后懸浮于Dulbecco's Hanks平衡鹽溶液(Dulbecco's Hanks balanced salt solution, D-Hanks)中,56℃加熱60min滅活。然后Potter-Elvehjem組織勻漿器將菌絲研磨成20～40μm長(zhǎng)的片段,濃度調(diào)整為1×106個(gè)菌絲體片段/ml,制成AF抗原刺激液。 2.細(xì)胞的培養(yǎng)：THSFs由Fu-Shin X.Yu教授和Ilene K. Gipson教授慷慨提供。細(xì)胞在37℃、5%CO2的濕潤(rùn)條件下用含10%新生牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)培養(yǎng)。細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔微培養(yǎng)板并生長(zhǎng)至80%融合(2天左右),不含血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓16h后用于刺激試驗(yàn)。 3.細(xì)胞的刺激和耐受的誘導(dǎo)：THSF細(xì)胞經(jīng)LPS (10ng/ml)預(yù)處理12h后用不含血清的培養(yǎng)基沖洗2次,給予AF菌絲(106個(gè)/ml)再次刺激。第2次刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(30min,1h,3h,6h)收取細(xì)胞,熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)TLR4mRNA的水平,或于第2次刺激后4h收取細(xì)胞及細(xì)胞上清,RT-PCR檢測(cè)TLR2的基因表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)IL-6、 IL-8和TNF-α的分泌。 4.抗體中和能力的測(cè)定和受體封閉實(shí)驗(yàn)：利用TLR2和TLR4的單克隆抗體孵育THSFs進(jìn)行受體封閉試驗(yàn)。THSF細(xì)胞與抗人TLR4(100ug/ml)、抗人TLR2(100ug/ml)或抗人TLR4(100ug/ml)+TLR2(100ug/ml)單克隆抗體共孵育30min后,37℃條件下酵母聚糖(1mg/ml)或LPS (1μg/ml)刺激12h,或LPS (10ng/ml)預(yù)處理12h后AF菌絲(106個(gè)/ml)再次刺激4h。收取細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液,ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8、TNF-α的分泌或RT-PCR檢測(cè)TLR2的表達(dá)。 [結(jié)果] 1.單克隆抗體可有效封閉TLR2及TLR4:TLR2、4抗體對(duì)THSF中IL-8和TNF-α的基礎(chǔ)分泌沒(méi)有影響,TLR2配體酵母聚糖或TLR4配體脂多糖均刺激THSF細(xì)胞高表達(dá)IL-8和TNF-α,中和性抗體封閉相應(yīng)TLR后這種刺激作用消失,抗體封閉組與空白對(duì)照組的炎性因子分泌量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此,我們使用的特異性單克隆抗體能夠有效的阻斷相應(yīng)TLRs的功能。 2.LPS預(yù)處理對(duì)大劑量AF誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)的影響：為了研究THSF細(xì)胞中LPS預(yù)處理對(duì)TLR4水平的調(diào)節(jié)作用,10ng/ml的LPS預(yù)處理12h后,煙曲霉菌菌絲再次刺激THSF, RT-PCR檢測(cè)TLR4的表達(dá)。結(jié)果顯示第二次刺激1小時(shí)、3小時(shí)后LPS預(yù)處理組TLR4mRNA的表達(dá)量均低于單純AF刺激組。 3.LPS預(yù)處理對(duì)煙曲霉菌刺激角膜基質(zhì)細(xì)胞炎性因子分泌的抑制作用依賴于TLR4的功能：在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),10ng/ml LPS預(yù)處理能減少再次煙曲霉菌刺激誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞IL-6和IL-8的分泌。在此我們進(jìn)一步探討這種炎性細(xì)胞因子表達(dá)的抑制現(xiàn)象是否依賴于TLR4的作用。在LPS預(yù)處理之前封閉TLR4,培養(yǎng)上清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量較未封閉TLR4的LPS預(yù)處理組增加,與未封閉TLR4的無(wú)預(yù)處理煙曲霉菌刺激組之間沒(méi)有明顯差異。 4.TLR2在LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程中的作用研究：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR2的表達(dá),結(jié)果顯示LPS預(yù)處理對(duì)煙曲霉菌誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞中TLR2mRNA的水平?jīng)]有明顯影響。雖然TLR4單克隆抗體對(duì)TLR2的基礎(chǔ)表達(dá)沒(méi)有刺激作用,但預(yù)處理前封閉TLR4, THSF細(xì)胞中煙曲霉菌刺激的TLR2表達(dá)明顯上調(diào)。LPS預(yù)處理前利用特異性抗體將TLR2與TLR4共同封閉,IL-6、IL-8和TNF-α的分泌較無(wú)預(yù)處理對(duì)照組明顯下降,接近基礎(chǔ)分泌水平。 [結(jié)論] 1.在角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程中,TLR4作為關(guān)鍵的受體,能特異性的介導(dǎo)LPS預(yù)處理引起的炎性細(xì)胞因子抑制。 2.LPS預(yù)處理對(duì)煙曲霉菌誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)沒(méi)有明顯影響,但是封閉TLR4后TLR2是維持炎性細(xì)胞因子分泌水平的關(guān)鍵因素。 第二部分LPS預(yù)處理誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程對(duì)TLR4下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控 [目的] 研究THSF細(xì)胞中LPS預(yù)處理對(duì)TLR4下游Myd88依賴的經(jīng)典途徑、Myd88依賴的MAPK途徑以及MyD88非依賴的TRIF途徑的影響。 [方法] 用小劑量LPS預(yù)處理12h后,再用大劑量AF刺激THSF,培養(yǎng)0.5、1、3、6、12小時(shí)分別收取細(xì)胞及培養(yǎng)上清,RT-PCR、ELISA及wenstern blot檢測(cè)Myd88依賴的經(jīng)典途徑的關(guān)鍵因子MyD88、IκB-α、NF-Kb-p65, Myd88依賴的MAPK途徑的關(guān)鍵因子MAPK3、AP-1、ERK1/2以及Myd88非依賴的TRIF途徑的關(guān)鍵因子TRIF、IRF-3、IFN-β的基因和蛋白水平；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-Kb-p65向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。 [結(jié)果] 1.Myd88依賴的經(jīng)典途徑的抑制：RT-PCR結(jié)果顯示煙曲霉菌再次刺激1小時(shí)、3小時(shí)后LPS預(yù)處理組MyD88mRNA的表達(dá)低于非預(yù)處理組；IκB-α mRNA及蛋白的表達(dá)高于非預(yù)處理組,間接說(shuō)明1小時(shí)、3小時(shí)LPS預(yù)處理組NF-κB的表達(dá)低于非預(yù)處理組；NF-κB-p65的蛋白表達(dá)低于非預(yù)處理組,向胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移也受到抑制。 2.Myd88依賴的MAPK途徑下游信號(hào)因子的表達(dá)下調(diào)：1小時(shí)、3小時(shí)LPS預(yù)處理組MAPK3、AP-1mRNA的表達(dá)均低于非預(yù)處理組,western blot結(jié)果顯示1小時(shí)、3小時(shí)ERK1/2的蛋白表達(dá)量預(yù)處理組也明顯低于無(wú)預(yù)處理組。 3.Myd88非依賴的TRIF途徑下游信號(hào)因子表達(dá)和細(xì)胞因子分泌上調(diào)：LPS預(yù)處理后再用煙曲霉菌菌絲刺激THSF細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示真菌刺激3小時(shí)、6小時(shí)后TRIF、IRF3、IFN-β mRNA的表達(dá)增加,而LPS預(yù)處理組TRIF途徑關(guān)鍵信號(hào)因子的水平較無(wú)預(yù)處理組進(jìn)一步升高。IFN-β的ELISA檢測(cè)顯示了一致的結(jié)果。 [結(jié)論] 1.在角膜基質(zhì)細(xì)胞再編程中,介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的Myd88依賴的經(jīng)典途徑以及Myd88依賴的MAPK途徑作用受到抑制。 2.LPS預(yù)處理促進(jìn)MyD88非依賴的TRIF途徑的功能,進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R772.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1644871