本文選題：慢病毒　切入點：microRNA-155　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：microRNAs (miRNAs)是一類大小約為18-23 nt的小分子非編碼RNA,其發(fā)現(xiàn)被譽為2002年世界十大科技突破之首。miRNAs由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70～90個堿基大小的單鏈niRNA前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer加工產(chǎn)生而成,廣泛存在于生物界中,自第一個miRNA分子在線蟲中發(fā)現(xiàn)后,在動物、植物以及病毒中已經(jīng)有24521個miRNAs分子被鑒定,在人體中niRNAs的種類也超過了2200種。miRNAs以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,而且絕大部分定位于基因間隔區(qū),其轉(zhuǎn)錄獨立于其他的編碼基因,并不參與蛋白質(zhì)的翻譯。miRNA主要通過降解靶mRNAs或抑制靶mRNAs編碼蛋白質(zhì)的翻譯,從而沉默特定的靶基因,從而發(fā)揮生物學(xué)作用；某些miRNAs還能改變相應(yīng)mRNAs的半衰期來調(diào)控基因的表達(dá)。miRNAs的序列也不是任意的,在很大的進(jìn)化距離中具有保守性。通過生物信息學(xué)手段可以發(fā)現(xiàn),人類約有1/3以上的蛋白編碼基因受到miRNAs的調(diào)節(jié)。niRNAs通過調(diào)節(jié)目的蛋白的表達(dá),在生物體的早期發(fā)育、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞死亡,細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等生理和病理過程中都發(fā)揮著重要的作用。單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1, HSV-1)感染眼部所引起的單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)可導(dǎo)致角膜溶解、新生血管形成、潰瘍穿孔乃至全眼球炎等嚴(yán)重的病理改變。本病復(fù)發(fā)率高且嚴(yán)重?fù)p害視功能,是全球致盲率第一位的角膜病變1-3。盡管迄今為止,關(guān)于HSK的研究取得了一定的進(jìn)展,對于這種疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及防治有了一定程度上的認(rèn)識。但在這些領(lǐng)域還有很多未知的空白有待填補。越來越多的證據(jù)表明：miRNAs作為機體內(nèi)各種生理及病理活動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與了固有免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。就宿主與病毒而言,miRNAs的調(diào)控既參與了宿主對自身的保護機制和對病毒的抑制,又參與了病原體對抗宿主免疫過程。那么,HSV-1感染引起HSK炎癥反應(yīng)早期是否影響了角膜組織miRNAs的表達(dá)?miRNAs是否參與HSK的炎癥反應(yīng)?作用機制又如何?上述問題目前國外研究尚少,國內(nèi)均未見系統(tǒng)報道。有鑒于此,我們首先以HSV-1感染小鼠角膜,建立HSK炎癥反應(yīng)模型,并以此為研究對象,利用基因芯片等技術(shù)系統(tǒng)分析了HSV-1感染后角膜組織miRNA表達(dá)譜的改變情況,并且利用生物信息學(xué)技術(shù)分析差異miRNAs的作用；在此基礎(chǔ)上,我們對表達(dá)變化最為明顯的miRNA-155在HSK炎癥反應(yīng)中促炎作用的分子機制展開研究,評價了miRNA-155對HSK臨床表現(xiàn)的影響。本課題擬通過對以上科學(xué)問題的探討,一定程度上闡明HSK炎癥反應(yīng)的的非編碼RNA機制,為后續(xù)的疾病治療及藥物開發(fā)提供理論和實驗基礎(chǔ)。第一部分HSV-1感染引起角膜組織microRNA表達(dá)譜變化及功能分析目的：(1)運用miRNA芯片法檢測HSV-1感染后導(dǎo)致的HSK小鼠角膜組織與正常小鼠角膜組織的miRNA表達(dá)譜變化,初步篩選出差異miRNAs。(2)將芯片結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)驗證,運用qRT-PCR確定HSK與正常小鼠角膜組織中表達(dá)差異的miRNAs。(3)運用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測差異miRNAs的靶基因,分析差異靶基因的功能,構(gòu)建MicroRNA-GO-Network,研究miRNAs調(diào)節(jié)的主要生物學(xué)功能,討論其在HSK發(fā)病過程中的作用。方法：(1)C57BL/6小鼠共40只,構(gòu)建小鼠HSK動物模型,隨機分為2組：對照組20只,僅對該組小鼠行角膜“十”字劃傷,接種病毒培養(yǎng)液；實驗組20只,該組小鼠在給予“十”字劃傷后,將Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)滴入結(jié)膜囊,按摩30s。劃傷眼每日以0.5%慶大霉素眼液滴眼建立小鼠HSK模型。(2)獲取實驗組與對照組小鼠角膜組織,利用Affymetrix miRNA 3.0芯片分析二者miRNA表達(dá)譜系的差異,找出表達(dá)水平顯著改變的miRNAs.(3)選取芯片結(jié)果中差異性表達(dá)明顯(上調(diào)或下調(diào)超過2倍)的成熟miRNAs,運用qRT-PCR技術(shù)對miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行驗證,確定HSK角膜組織中差異表達(dá)的miRNAs.(4)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測差異miRNAs的靶基因,構(gòu)建靶基因功能網(wǎng)絡(luò),確定差異miRNAs與炎癥反應(yīng)相關(guān)的主要功能。結(jié)果(1)裂隙燈觀察術(shù)后小鼠,術(shù)后7天小鼠明顯發(fā)病,角膜上皮見上皮完整性破壞,角膜混濁明顯,新生血管形成�？梢娦∈蠼悄ぁ笆弊謩澓鄯ń⒌腍SK的模型有很好的可操作性和重復(fù)性,模型成功率為90%,可以用于miRNA表達(dá)譜變化的研究。(2)基因芯片結(jié)果顯示,共有34個miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)：mmu-miRs-5100,-21-3p,-133a-3p,-18a-5p,-150-5p,-155-5p,-133b-3p,-139-5p,-146a-5p,-206-3p,-124-3p,-300-3p,-5115,-5097,-1224-5p,-720,-712-5p,-342-3p,-223-3p,-714,-17-3p,-1934-3p,-204-5p,-3968,-21-5p,-3096b-5p,-200a-3p,-204-3p,-148a-3p, -181c-5p, -346-3p, -434-3p,-711,-762.其中15個miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)在2倍以上,其中mmu-miRs-223-3p,-155-5p,-21-3p,-150-5p,-18a-5p,-3096b-5p,-146a-5p,and -342-3p表達(dá)上調(diào)；mmu-miRs-434-3p,-124-3p,-204-5p,-133b-3p,-206-3p,and -133a-3p表達(dá)下調(diào)。(3)qRT-PCR證實,niRs-204-5p,-206-3p,-155-5p,-133a-3p,and -150-5p在HSK角膜組織中有明顯差異性表達(dá)。(4)上述5個miRNAs共有125潛在靶點。92個上調(diào)的基因受到mmu-miRs-204-5p,-206-3p,及-133a-3p三個下調(diào)基因的調(diào)控；33個下調(diào)基因受到mmu-miRs-155-5p及-150-5p兩個上調(diào)基因的調(diào)控。(5)miRNAs靶基因網(wǎng)絡(luò)及功能分析顯示,5種差異miRNAs靶基因共同具有的與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的功能為細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控及細(xì)胞黏附。結(jié)論：(1)角膜“十”字劃痕法建立的HSK的小鼠模型有很好的可操作性和重復(fù)性,可以用于miRNAs表達(dá)譜差異的研究。(2) miRNA芯片顯示HSV-1感染造成的HSK角膜組織與對照組角膜組織中miRNAs表達(dá)譜有明顯差異,34種miRNAs出現(xiàn)了表達(dá)變化。(3) qRT-PCR證實5種miRNA在HSK角膜組織中有明顯差異性表達(dá),差異的趨勢與芯片結(jié)果相同。(4)表達(dá)差異的miRNA有多達(dá)125個潛在靶點。靶基因的共同的主要功能中,細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控及細(xì)胞黏附,與炎癥反應(yīng)高度相關(guān)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的功能為細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控及細(xì)胞黏附。第二部分microRNA-155于單純皰疹病毒性角膜炎炎癥反應(yīng)調(diào)控作用初探目的：(1)探索miRNA-155局部在體下調(diào)小鼠模型的建立方法。(2)探討miRNA-155影響小鼠HSK炎癥反應(yīng)程度的分子學(xué)機制。(3)探索miRNA-155局部下調(diào)對小鼠HSK角膜炎癥反應(yīng)臨床表現(xiàn)的影響。方法：(1)C57BL/6小鼠共30只,組1右眼前房內(nèi)注射慢病毒,左眼注射等量NS；組2右眼角膜上皮劃傷,載體慢病毒液浸潤,左眼同樣方法以NS對照；組3右眼前房注射空質(zhì)粒病毒載體,左眼刮傷上皮,浸潤等量空質(zhì)粒病毒載體。建模后第3、5、7天裂隙燈下觀察GFP于角膜部位的表達(dá)。于第7天取角膜,切片后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)。(2)C57BL/6小鼠50只,10只“十”字劃傷建立HSK模型,20只“十”字劃傷建立HSK模型后角膜上皮劃傷慢病毒浸潤法轉(zhuǎn)染miRNA-155下調(diào)質(zhì)粒,構(gòu)建miRNA-155局部下調(diào)HSK小鼠模型,20只同樣方法建立陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSK小鼠模型。建模后7天,選取GFP表達(dá)占角膜面積20%以上的HSK小鼠角膜,qRT-PCR法檢測IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IFN-y, TNF-a, CXCL1的表達(dá)水平(3)C57BL/6小鼠50只,按照上述方法建立HSK小鼠10只、miRNA-155下調(diào)HSK及陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSK模型各20只。建模后7天,選取GFP角膜表達(dá)占角膜面積20%以上的HSK小鼠,雙盲法采用Heiligenhaus等[1]及Foster等[2]介紹的標(biāo)準(zhǔn)對小鼠HSK臨床表現(xiàn)進(jìn)行評估。結(jié)果(1)裂隙燈觀察角膜劃傷后局部浸潤慢病毒的小鼠角膜,術(shù)后3天可見明顯GFP表達(dá),5天表達(dá)增多；7天時GFP面積最大,強度增強；前房注射法未見GFP熒光表達(dá)。熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒主要感染部位為角膜上皮及淺基質(zhì)可以用于miRNA下調(diào)的研究。(2) qRT-PCR結(jié)果顯示,HSK組,miRNA-155下調(diào)HSK,及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSK組IL-17及CXCL1表達(dá)差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。(3)臨床表現(xiàn)評分顯示,HSK組,：niRNA-155下調(diào)HSK,及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSK組于感染后3天,5天及7天角膜上皮損傷,角膜混濁及新生血管程度差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：(1)角膜局部劃傷慢病毒浸潤后,載體可轉(zhuǎn)染小鼠角膜上皮及淺基質(zhì)層,有較好的可操作性,可以用于miRNA功能的研究。(2) miRNA-155下調(diào)可減少角膜IL-17及CXCL1的表達(dá)。HSK發(fā)病過程中,miRNA-155可能通過影響炎癥因子的表達(dá)水平調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生及其嚴(yán)重程度。(3)基于現(xiàn)有的模型樣本量,miRNA-155局部下調(diào)對HSK臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度無明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R772.21

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳欣怡;陳國玲;韓少平;;核轉(zhuǎn)錄因子κB在脂多糖誘發(fā)的大鼠角膜炎中的表達(dá)及二硫代氨基甲酸吡咯烷對其的影響[J];中華眼科雜志;2006年08期

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本文編號：1639430