本文選題：鼻咽癌　切入點：miR156a　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景和目的 鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤,其惡性程度較高,且具有極強的轉(zhuǎn)移能力。我國是鼻咽癌發(fā)病率最高的國家,以廣東、廣西、湖南、福建等南方地區(qū)為著。放射治療是鼻咽癌的重要根治性手段,盡管放療技術的進步是使得鼻咽癌患者5年生存率和無病生存率明顯提高,但仍不盡人意。 microRNA (miRNA)是一類長度在22nt左右的內(nèi)源非編碼小RNA,廣泛存在于動物、植物和病毒等多種有機體中,并在動物與植物的發(fā)育成熟、疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療方面起重要作用。近來研究表明,一些在調(diào)節(jié)細胞侵襲和干細胞樣特性方面起重要作用rniRNA已成為腫瘤預防和治療的重要靶標。新一代的高通量測序技術被廣泛運用于1niRNA的發(fā)掘。這種高通量的測序技術得以大量發(fā)現(xiàn)非保守及表達量較低的miRNA。至目前為止,miRBase數(shù)據(jù)庫中收集的193個物種的成熟miRNA中有7384條序列來自于植物,其中包括337條擬南芥miRNA,713條水稻miRNA和43條大白菜miRNA。研究顯示,植物miRNA能通過進入哺乳動物體內(nèi)并起作用。Zhang等人的研究結(jié)果顯示植物miRNA同樣能在人、小鼠及小牛的血漿中被發(fā)現(xiàn),并能通過結(jié)合至哺乳動物的靶]mRNA的外顯子區(qū)域抑制靶基因蛋白表達。因此,我們初步假設西蘭花能通過rniRNA影響腫瘤細胞生物學效應。 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細胞的生物學過程,是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程,是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要階段。EMT的發(fā)生表現(xiàn)為上皮源性的腫瘤細胞失去細胞極性,細胞間的連接變得疏松,胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組；轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist表達上調(diào),上皮標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和緊密連接蛋白ZO-1(zonula occluden-1)等表達下調(diào)；間質(zhì)標志物波形蛋白(vimentin)和N型鈣粘蛋白(N-cadherin)等表達上調(diào)。這一系列的改變導致腫瘤細胞的黏附能力下降,遷移運動能力增加,使得腫瘤細胞更易于離開原有位置；并使細胞獲得干細胞樣特性成為腫瘤干細胞。 人交界粘連分子(unctional adhesion molecule-A, JAM-A)是位于細胞間的跨膜緊密連接蛋白,它在細胞的侵襲、血小板聚集和淋巴細胞粘附等方面起重要作用。研究顯示,JAMA蛋白能激活細胞中Rap1(小分子G蛋白Ras超家族成員之一)顯著影響與細胞粘附功能密切相關的E-鈣粘蛋白等表達。更重要的是,在腫瘤轉(zhuǎn)移及EMT等過程中扮演重要角色的PI3K/Akt通路能被Rap1激活。因此,我們假設JAM-A能通過PI3K/Akt通路影響腫瘤EMT特性。 十字花科植物包含大量蔬菜,其中包括西蘭花、花椰菜、甘藍和芥菜等。研究顯示,十字花科植物具有較好的抗腫瘤效果。西蘭花是起源于意大利的甘藍,流行病學研究顯示十字花科植物能顯著降低腫瘤的發(fā)生,尤其是肺癌、胃腸道癌癥和前列腺癌。最近研究顯示西蘭花中含有攻擊腫瘤細胞的化合物。 總之,已經(jīng)有大量研究顯示西蘭花具有明顯的抗腫瘤作用,且有報道顯示,植物rnicroRNA能通過微囊進入體內(nèi)降低哺乳動物體內(nèi)甘油三酯含量,目前尚未有西蘭花通過microRNA影響腫瘤細胞生物學行為報道。因此,以前人研究報道為基礎,我們假設西蘭花能通過其中的miRNA影響腫瘤細胞生物學行為。我們首先研究了西蘭花中miRNA'情況,找到其中可能的具有抗腫瘤的miRNA進行進一步的研究。 方法 第一章高通量測序檢測西蘭花中miRN及其生物信息學分析方法的建立 1.西蘭花總RNA提取與鑒定將組織在液氮中磨成粉末后,參照Trizol說明提取西蘭花中總RNA。 2.測定RNA濃度度及完整性。 3.西蘭花RNA電泳鑒定使用15%的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠對提取的西蘭花中總RNA進行電泳檢測；AgilentBioanalyzer分析所獲得的RNA完整性。 4.對完整性及濃度合格的RNA進行小、RNA (small RNA, sRNA)建庫：分離得到18-30nt大小片段,連接5’端接頭及3’接頭,反轉(zhuǎn)錄為cDNA并行PCR擴增,上機測序最后由華大基因研究所完成。 5.熒光定量PCR驗證測序獲得的西蘭花中保守及新鑒定的miRNA。 6.西蘭花中miRNA高通量檢測完成后生物信息學分析首先對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭、污染序列及低質(zhì)量讀本的處理；通過SOAP程序?qū)⑸鲜鏊玫降腸lean sRNA與大白菜(Brassica rapa, B.rapa)基因組比對,將所獲得的sRNA定位至基因組；進一步對所獲得的sRNA進行注釋比對,最后鑒定已知miRNA及新miRNA。 7.采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。熒光定量RT-PCR檢測西蘭花中rniRNA含量、植物miRNA在根莖葉中表達差異及rniRNA在哺乳動物體內(nèi)含量情況采用單因素方差分析(One-way ANONA);多重比較采用LSD方法(方差齊性)及Dunett'T3(方差不齊)。P0.05為有統(tǒng)計學差異,數(shù)值大小以均值±標準差(x±s)來表示。 第二章細胞間緊密連接蛋白JAM-A對鼻咽癌細胞株EMT的影響 1.JAMA質(zhì)粒構(gòu)建及過表達細胞株建立首先從CNE2細胞株基因組中克隆得到完整的目的基因(JAM-A CDS區(qū))。T4連接酶連接酶切成功的載體及克隆產(chǎn)物。對連接成功產(chǎn)物進行擴增、鑒定并行測序驗證；病毒包裝成功后感染細胞。 2.劃痕實驗用10ul無菌槍頭沿培養(yǎng)皿底對培養(yǎng)密集細胞呈“一”字形劃痕,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),倒置顯微鏡下拍照觀察。 3. Transwell及Boyden檢測轉(zhuǎn)染前后細胞侵襲能力。 4. Western blotting檢測與EMT相關蛋白表達。 5.免疫組化免疫組化分析172例鼻咽癌組織標本,并行統(tǒng)計分析。 6.統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。JAM-A上調(diào)和下調(diào)影響鼻咽癌細胞株EMT發(fā)生(2.5和2.6)中數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANONA);多重比較采用LSD方法(方差齊性)及Dunett'T3(方差不齊)。JAM-A影響細胞株放療抵抗及對信號通路影響(2.7及2.8中數(shù)據(jù))采用析因設計的方差分析。P0.05為有統(tǒng)計學差異,數(shù)值大小以均值±標準差(x±s)來表示。臨床數(shù)據(jù)采用卡方檢驗；臨床病理中JAM-A表達與預后關系采用Kaplan-Meier及l(fā)og-rank進行統(tǒng)計分析。 第三章miR156a通過JAM-抑制鼻咽癌細胞株EMT 1.CCK-8法了解miR156a合適濃度胰酶消化細胞后計數(shù)細胞,鋪板。予不同不同濃度miRNA156a處理細胞,區(qū)不同時間時間點檢測CCK8數(shù)值。 2.生物信息學分析在miRBase中查找西蘭花同種屬miR156a序列；結(jié)合南京大學zhang等人預測條件,由華大基因完成。 3.靶基因目的片段的獲取利用PCR反應克隆目的片段,酶切psiCHECK2質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物,并連接測序；定點突變參照碧云天突變試劑盒完成。 4.細胞轉(zhuǎn)染實驗參照第二部分完成。 5.雙熒光素酶報告基因檢測miR156a對JAM-A基因3'UTR區(qū)的結(jié)合作用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值驗證3’-UTR靶向結(jié)合位點活性。 6.統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。MiR156a抑制鼻咽癌細胞株EMT、靶基因驗證均采用采用單因素方差分析(One-way ANONA);多重比較采用LSD方法(方差齊性)及Dunett'T3(方差不齊)。P0.05為有統(tǒng)計學差異,數(shù)值大小以均值±標準差(x±s)來表示。 結(jié)果 第一章高通量測序檢測西蘭花中miRNA及其生物信息學分析方法的建立 1.西蘭花中sRNA的分析成功構(gòu)建西蘭花sRNA文庫后對所測數(shù)據(jù)的sRNA序列長度進行分布統(tǒng)計,其中24-nt sRNA含量最高；其次是22和23-ntsRNAs。將西蘭花sRNA與B.rapa基因組匹配,基因定位分析顯示,這些sRNA幾乎均勻的分布在A1至A13染色體上。 2.西蘭花中保守miRNA的高通量分析西蘭花中檢測到了84條保守存在于多種植物中的miRNA在。半定量RT-PCR驗證miR156a, miR168a和miR157d在西蘭花中表達量最高,而miR165a-3p表達量相對較低。 3.西蘭花中新miRNA的預測我們共鑒定了西蘭花中184條新miRNA。這些新miRNA平均拷貝數(shù)為130,明顯低于保守miRNA平均拷貝數(shù)。依據(jù)Mfold測算結(jié)果,新miRNA前體形成二聚體的平均最小自由能為-47.8kcal/mol(-18.5至-123kcal/mol)。 4.植物miRNA在根、莖及葉中差異表達miR156a, miR168a和miR172b在花、莖和葉中表達量較高。盡管miR156a在所有組織中廣泛表達,但在花和葉中表達量最高。 第二章細胞間緊密連接蛋白JAMA對鼻咽癌細胞株EMT發(fā)生的影響 1.成功構(gòu)建JAM-A過表達質(zhì)粒為構(gòu)建JAM-A過表達質(zhì)粒,首先從鼻咽癌細胞株中提取獲得基因組DNA,擴增獲得JAM-A CDS區(qū)域。質(zhì)粒酶切PCR產(chǎn)物及載體質(zhì)粒,連接、測序成功后感染病毒,成功獲得過表達質(zhì)粒。 2.異位過表達JAM-A能在體外誘導EMT的發(fā)生并增加鼻咽癌細胞的侵襲和遷移能力。Transwell檢測結(jié)果顯示,每高倍鏡下CNE2細胞數(shù)量從對照組的12.47增加至JAM-A過表達組的26.23(F=225.6,P0.01)。劃痕實驗檢測的愈合指數(shù)同樣明顯增加,劃痕24小時后,愈合指數(shù)從對照組的47%增加至JAM-A過表達組的62%(F=20.53,P=0.02)。Western blotting結(jié)果顯示,上皮細胞標記物a-Catenin和E-cadherin減低,而Vimentin表達量升高。 3.下調(diào)JAM-A表達能抑制鼻咽癌EMT發(fā)生我們設計的JAM-A shRNA#1和shRNA#2均能下調(diào)鼻咽癌細胞株中JAM-A表達。JAM-A下調(diào)后,CNE2和HONE1中E-Cadherin表達明顯上升,Vimentin表達量明顯下降。劃痕實驗結(jié)果顯示,JAM-A下調(diào)能減低鼻咽癌細胞株愈合指數(shù)及鼻咽癌細胞株侵襲能力。隨著JAM-A的下調(diào),鼻咽癌細胞株球囊形成數(shù)量、軟瓊脂克隆形成能力明顯下降。 4. JAM-A高表達患者遠處轉(zhuǎn)移率明顯升高,預后顯著差于JAM-A陰性患者。為進一步研究JAM-A表達水平在鼻咽癌病人中的重要性,我們利用免疫組化法分析了172例確診為鼻咽癌患者的JAM-A表達水平。結(jié)果顯示,JAM-A主要在細胞膜及少量胞漿中表達。Kaplan-Meier以及l(fā)og-rank分析JAM-A表達與總生存及無病生存率分析結(jié)果顯示,高表達JAM-A蛋白總生存明顯差于JAM-A陰性組(P0.01)。另外,JAM-A高表達組的5年無病生存率明顯短于JAM-A陰性組(P0.01)。 第三章miR156a通過JAM-A抑制鼻咽癌細胞株EMT 1.體外實驗結(jié)果顯示,植物miR156a能抑制鼻咽癌細胞株EMT和干細胞樣特性為了初步研究西蘭花miR156a能否抑制腫瘤EMT, Transwell和Boyden檢測結(jié)果顯示,miR156a能抑制鼻咽癌細胞株CNE2和HONE1侵襲能力。Western blotting分析顯示,轉(zhuǎn)染miR156a后,a-Catenin和E-cadherin表達水平明顯升高,Vimentin減低。 2.生物信息學預測miR156a靶基因及雙熒光素酶報告載體驗證生物信息學方法預測了miR156a40個可能的靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,miR156a能結(jié)合至JAM-A mRNA3'UTR區(qū)域。在鼻咽癌細胞株和293T細胞株中,共轉(zhuǎn)染miR156a和JAM-A-3'UTR組,減低了熒光素酶報告基因的表達翻譯,熒光強度明顯減弱,轉(zhuǎn)錄陰性對照或psiCHECKTM-2/JAM-A/mut的共轉(zhuǎn)體系,下游熒光素霉報告基因可以表達,產(chǎn)物熒光強度較高。 3. MiR156a通過JAM-A誘導鼻咽癌細胞株EMT鼻咽癌細胞株轉(zhuǎn)染miR156a mimic后JAM-A蛋白表達減低,而上皮細胞標記物E-cadherin表達上升。 結(jié)論 1.西蘭花中存在大量sRNA,其中以21nt miRNA和24nt siRNA含量最多;通過高通量測序方法檢測發(fā)現(xiàn)了西蘭花中84條保守miRNA和184條新miRNA。 2. miRNA156a在西蘭花根、莖及葉中均有表達,在花中表達量最高。 3. JAM-A能在體內(nèi)及體外誘導鼻咽細胞株EMT的發(fā)生。鼻咽病理組織結(jié)果顯示,高表達JAM-A與鼻咽癌病人不良預后及遠處轉(zhuǎn)移明顯正相關性。 4. miR156a能通過結(jié)合至JAM-A mRNA的3'UTR區(qū)抑制鼻咽癌細胞株EMT表型和干細胞樣特性。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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1 ;Isolation and Identification of Cancer Stem-Like Cells from Murine Melanoma Cell Lines[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年06期

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本文編號：1611897