本文選題：脈絡(luò)膜新生血管　切入點(diǎn)：Notch信號(hào)通路　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【研究背景】 新生血管生成是眼內(nèi)新生血管疾病,如年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration,AMD)、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)等眼病共有的病理改變和重要臨床表現(xiàn),其相伴隨的滲出、出血和纖維化等一系列病理改變可嚴(yán)重破壞眼的結(jié)構(gòu)和功能,最終導(dǎo)致患者不同程度的視力障礙。在其發(fā)生機(jī)制中,多種誘發(fā)因素參與對(duì)眼底視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的破壞,組織發(fā)生過(guò)多的反應(yīng)性修復(fù),在組織學(xué)中呈現(xiàn)視網(wǎng)膜前、視網(wǎng)膜內(nèi)或視網(wǎng)膜下新生血管生長(zhǎng)的病理改變。 在多種類型的眼內(nèi)新生血管中,脈絡(luò)膜新生血管( choroidal neovascularization, CNV)是來(lái)自脈絡(luò)膜毛細(xì)血管網(wǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)Bruch膜的裂口遷移和增生,生長(zhǎng)于Bruch膜與視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigment epithelium,RPE)之間、或神經(jīng)視網(wǎng)膜與RPE之間、或位于RPE與脈絡(luò)膜之間的新生血管叢。包括變性、遺傳、炎癥、腫瘤和外傷等多種因素均可造成RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的損害,因而常伴發(fā)有CNV的生成。其中,繼發(fā)于AMD的CNV較多見(jiàn)于黃斑部,嚴(yán)重地?fù)p害中心視力,已成為老年人致盲的主要原因之一。CNV的發(fā)生機(jī)制尚不十分明確,但眾多研究已證實(shí)多種細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)共同構(gòu)成CNV局部的微環(huán)境,并通過(guò)細(xì)胞、因子及信號(hào)通路之間的交互作用對(duì)CNV的生成發(fā)揮重要調(diào)控作用。因而,深入的機(jī)制研究為CNV的臨床治療開(kāi)拓了新的方向。目前靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的制劑已經(jīng)通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證,而臨床研究發(fā)現(xiàn)其治療可有效地抑制新生血管生成,且有利于改善視力。然而,VEGF同時(shí)具有維持血管正常通透和機(jī)能及神經(jīng)保護(hù)的功能,長(zhǎng)期反復(fù)使用抗VEGF藥物,其安全性和療效的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步觀察研究。更重要的是,在CNV的微環(huán)境中并不僅僅只有VEGF參與CNV的生成,單一抗VEGF治療可能并不足以達(dá)到理想治療效果,因而,深入研究CNV微環(huán)境中的其他重要因子,并探討其治療潛能,可為靶向治療CNV提供新的突破口。 Notch信號(hào)通路在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中高度保守而廣泛存在于各組織。最近研究表明,Notch信號(hào)通路中多種配體和受體在血管系統(tǒng)中表達(dá),對(duì)胚胎及成年個(gè)體的生理性和病理性血管新生發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。值得一提的是,在胚胎期因基因單倍劑量缺失造成血管異構(gòu)而最終致死的研究中,目前發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的只有兩個(gè)基因,即Notch信號(hào)通路中的配體分子Delta like 4 (Dll4)和VEGF,這提示Notch信號(hào)在對(duì)血管的調(diào)控中可能和VEGF具有著同等重要的地位。但不同于VEGF對(duì)血管生長(zhǎng)進(jìn)行的遠(yuǎn)位調(diào)節(jié),目前多認(rèn)為Notch信號(hào)通過(guò)膜配體和膜受體的接觸發(fā)生細(xì)胞間的信號(hào)傳遞,從而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞的活化和功能。最近兩年來(lái),Notch信號(hào)在眼底視網(wǎng)膜血管發(fā)育及某些眼內(nèi)新生血管疾病中的重要作用被發(fā)現(xiàn)并重視,但Notch信號(hào)通路是否參與CNV的生成,且其是否具有治療CNV的潛能等諸多問(wèn)題有待研究。 【目的】 觀察Notch信號(hào)通路對(duì)眼部及全身血管穩(wěn)態(tài)的維持作用,研究Notch信號(hào)通路對(duì)CNV生長(zhǎng)及相關(guān)重要細(xì)胞的調(diào)控作用,從新的角度探討Notch信號(hào)通路通過(guò)骨髓來(lái)源細(xì)胞(bone marrow derived cells,BMC)參與CNV生長(zhǎng)的調(diào)控作用,進(jìn)一步探尋Notch信號(hào)通路對(duì)CNV的潛在治療可能,為CNV治療策略的拓展提供新的理論依據(jù)。 【方法】 1、建立誘導(dǎo)性基因敲除小鼠。交配繁育RBP-Jflox/WT、Mx-Cre和ROSA小鼠,得到Mx-Cre-RBP-Jflox/WT小鼠、Mx-Cre-RBP-Jflox/flox小鼠和Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠,小鼠于出生后4周開(kāi)始以500μg總劑量的poly:I-C誘導(dǎo)(以腹腔注射的方式分5次間隔進(jìn)行); 2、采用組織病理學(xué)等技術(shù),觀察RBP-J/Notch信號(hào)敲除后,小鼠眼部及全身其他臟器的血管變化以及皮下接種Matrigel膠內(nèi)的血管生長(zhǎng)情況; 3、利用532nm激光建立小鼠CNV模型,通過(guò)熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和組織病理學(xué)技術(shù),觀察RBP-J/Notch信號(hào)敲除小鼠上CNV及接受RBP-J/Notch信號(hào)敲除小鼠骨髓移植的嵌合體小鼠上CNV的嚴(yán)重程度; 4、利用體外原代培養(yǎng)RBP-J/Notch信號(hào)敲除小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC),研究Notch信號(hào)缺失對(duì)相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 5、分別利用?-secretase抑制劑GSI體外阻斷和外源性給予Dll1融合蛋白體外激活培養(yǎng)人RPE細(xì)胞和胚胎來(lái)源彌猴視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞系RF/6A中的Notch信號(hào)通路,觀察Notch信號(hào)對(duì)CNV中重要細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控。 6、對(duì)出生后乳鼠于天齡4d(P4)皮下注射血管靶向型Dll1-RGD融合蛋白,并對(duì)激光誘導(dǎo)CNV的野生型小鼠于激光誘導(dǎo)后1天行尾靜脈注射Dll1-RGD融合蛋白,觀察外源性血管靶向增強(qiáng)Notch信號(hào)的激活對(duì)視網(wǎng)膜血管發(fā)育和CNV生長(zhǎng)的作用。 【結(jié)果】 1、通過(guò)繁育RBP-Jflox/WT和Mx-Cre小鼠,獲得了Mx-Cre-RBP-Jflox/WT和Mx-Cre-RBP-Jflox/flox小鼠;通過(guò)繁育ROSA和Mx-Cre-RBP-Jflox小鼠交配,獲得了Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠。Mx-Cre-RBP-Jflox/WT小鼠、Mx-Cre-RBP-Jflox/flox小鼠和Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠經(jīng)poly:I-C誘導(dǎo)后,對(duì)Mx-Cre-RBP-Jflox-ROSA小鼠耳部皮膚及視網(wǎng)膜血管行X-gal染色可見(jiàn)明顯藍(lán)染,表明小鼠血管開(kāi)始高效表達(dá)Cre重組酶。Cre重組酶表達(dá)的同時(shí)可通過(guò)DNA重組敲除RBP-J/Notch信號(hào),最終得到RBP-J (-/-)小鼠,即基因敲除小鼠(KO)和RBP-J (+/-)小鼠,即為基因部分存在的對(duì)照小鼠(CON)。 通過(guò)對(duì)KO小鼠和CON小鼠眼部及全身血管的觀察,本研究結(jié)果顯示RBP-J/Notch信號(hào)缺失時(shí),小鼠眼部(角膜、虹膜和視網(wǎng)膜)及全身其他器官(肝臟和肺臟)的血管穩(wěn)態(tài)的破壞,出現(xiàn)大量自發(fā)性新生血管。在小鼠皮下接種Matrigel膠5天后,KO小鼠皮下接種的膠內(nèi)長(zhǎng)入大量新生血管并誘發(fā)出血。體外培養(yǎng)的KO小鼠的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),體外KO小鼠的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成中血管萌枝增多。分子水平檢測(cè)結(jié)果顯示KO小鼠內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR2表達(dá)上調(diào),VEGFR1表達(dá)下調(diào),且細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21WAF1/CIP1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)下調(diào)。 2、對(duì)RBP-J基因敲除小鼠(KO)及對(duì)照小鼠(CON)上建立激光誘導(dǎo)的CNV,結(jié)果顯示Notch信號(hào)缺失時(shí), FFA顯示新生血管的滲漏程度加重,且生成率增加,而組織病理學(xué)統(tǒng)計(jì)CNV厚度和面積均大于對(duì)照組小鼠。在研究Notch信號(hào)對(duì)于CNV相關(guān)細(xì)胞的作用中,使用?-secretase抑制劑GSI阻斷細(xì)胞內(nèi)的Notch信號(hào),細(xì)胞免疫組化和劃痕實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)到體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞的增殖和遷移減弱;而RF/6A增殖能力增強(qiáng),但管腔形成能力減弱。 3、通過(guò)骨髓移植成功建立接受KO及CON小鼠骨髓的嵌合體小鼠,并建立激光誘導(dǎo)的CNV,可見(jiàn)到接受KO小鼠骨髓移植的嵌合體小鼠CNV生成加重。KO及CON小鼠骨髓經(jīng)Dio染色后移植到野生型小鼠體內(nèi),對(duì)獲得的嵌合體小鼠建立的激光誘導(dǎo)CNV,可見(jiàn)CNV區(qū)域有綠色熒光細(xì)胞的浸潤(rùn),且細(xì)胞上表達(dá)基質(zhì)衍生因子受體(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)。接受KO小鼠骨髓移植的小鼠CNV區(qū)域的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量減少。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)提示外周血EPC數(shù)量沒(méi)有明顯變化,而循環(huán)血中成熟的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯增加。通過(guò)原代培養(yǎng)小鼠的EPC,Transwell小室實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)KO小鼠的EPC對(duì)基質(zhì)衍生因子(stroma derived factor-1,SDF-1)的趨化能力減弱, EPC上CXCR4的表達(dá)下調(diào)。 4、P5及P15天新生小鼠的視網(wǎng)膜血管上,Notch信號(hào)的激活分別集中在頂端細(xì)胞和血管分叉處,而在野生型小鼠的激光誘導(dǎo)CNV區(qū)域,可見(jiàn)活化的Notch信號(hào)胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NICD)的表達(dá)上調(diào)。接受Dll1-RGD融合蛋白注射的乳鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育明顯較對(duì)照鼠遲緩,表現(xiàn)為血管分枝減少,血管內(nèi)頂端細(xì)胞數(shù)量減少。在接受Dll1-RGD注射的激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型中,脈絡(luò)膜鋪片顯示其CNV的最大面積明顯小于對(duì)照鼠。體外實(shí)驗(yàn)中,可見(jiàn)到RF/6A侵襲能力減弱,而管腔形成能力增強(qiáng),而RPE細(xì)胞的遷移能力減弱。 【結(jié)論】 本研究證實(shí),Notch信號(hào)在CNV的生成中發(fā)揮重要作用,Notch信號(hào)的缺失可加重CNV的生成,而外源性激活Notch信號(hào)對(duì)CNV的生成具有抑制作用。在成年個(gè)體中,Notch信號(hào)參與全身及眼部血管穩(wěn)態(tài)的維持,信號(hào)的缺失導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)及頂端細(xì)胞數(shù)量增加,這可能與Notch信號(hào)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VEGFR2、VEGFR1以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p21 WAF1/CIP1有關(guān)。 BMC同樣參與了CNV的生成,其中EPC被認(rèn)為可在CNV生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。KO小鼠外周血循環(huán)中的EPC數(shù)量未發(fā)生明顯變化,而循環(huán)中內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量顯著增加;Notch信號(hào)缺失時(shí),EPC對(duì)SDF-1的趨化作用反應(yīng)性降低,其原因可能是由于Notch信號(hào)缺失導(dǎo)致EPC上SDF-1受體CXCR4的表達(dá)下調(diào)。另外,Notch信號(hào)同時(shí)參與對(duì)RPE細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控,可能通過(guò)影響RPE的增殖和遷移參與到CNV的消退期中。但是需要注意的是,由于我們使用的是Notch信號(hào)全身性基因敲除小鼠,信號(hào)缺失后是否除內(nèi)皮細(xì)胞、BMCs和RPE細(xì)胞外其他細(xì)胞也因信號(hào)缺失參與CNV,這需要進(jìn)一步研究。 基于RBP-J/Notch信號(hào)的缺失導(dǎo)致CNV的加重,我們利用一種新型的融合蛋白Dll1-RGD以血管靶向性激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch信號(hào)通路,可見(jiàn)到Dll1-RGD全身性給藥抑制小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育及CNV的生成,這提示增強(qiáng)Notch通路的激活可能起到治療作用,但相關(guān)分子機(jī)制和長(zhǎng)期注射是否具有毒性作用仍需在今后工作中加以研究。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R773.4

【引證文獻(xiàn)】

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1 馬雪婷;血熱型銀屑病表皮中Notch信號(hào)分子的表達(dá)研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1611309