本文關(guān)鍵詞： 絲素蛋白-納米銀 鼻竇炎 生物膜 金黃色葡萄球菌 鼻腔沖洗 動物模型 炎癥反應(yīng)　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、背景與目的細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm, BBF)是指細(xì)菌附著于物體表面形成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu),表面被覆由細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多糖類聚合物并含有多種生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等。與浮游菌相比,BBF對抗生素的耐藥性以及對機(jī)體免疫清除作用的抵抗力均顯著增強(qiáng)。同時,BBF能不斷釋放游離菌,造成感染的反復(fù)急性發(fā)作。常規(guī)劑量的抗生素雖可控制BBF釋放出的浮游菌引起的感染,但卻無法殺滅生物膜內(nèi)部的細(xì)菌和清除生物膜。因此,目前普遍認(rèn)為BBF是導(dǎo)致持續(xù)性感染和慢性炎癥性疾病難以治愈的最常見原因。2004年,人們首次在慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis,CRS)患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)BBF,此后類似的發(fā)現(xiàn)越來越多�，F(xiàn)在普遍認(rèn)為BBF是一些CRS患者病情嚴(yán)重且治療效果差的主要原因。外科手術(shù)雖能有效清除BBF,但因肉眼無法辨別BBF累及黏膜的確切部位及范圍,因此單靠手術(shù)常難以達(dá)到徹底清除BBF的目的。研究表明,大環(huán)內(nèi)酯類藥物對呼吸道黏膜BBF相關(guān)性疾病(包括鼻竇炎)具有一定療效,但是應(yīng)用這類藥物進(jìn)行治療存在周期長、副反應(yīng)明顯、費(fèi)用昂貴和患者依從性差等問題。因此,BBF相關(guān)性鼻竇炎的有效治療是目前鼻科學(xué)領(lǐng)域需要重點(diǎn)解決的問題。借助于動物模型,可以更方便、深入地對這一問題進(jìn)行研究,但是目前僅有的兩種BBF相關(guān)性鼻竇炎動物模型均存在操作復(fù)雜、對動物鼻腔結(jié)構(gòu)損傷較大等問題,限制了此類研究的深入開展。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)是人類常見致病菌,也是導(dǎo)致人類BBF相關(guān)性疾病的常見病原菌,如何針對S. aureus及其生物膜進(jìn)行有效治療已成為目前臨床研究的熱點(diǎn)。研究表明,S. aureus也是形成CRS患者鼻黏膜上BBF的最常見致病菌,其BBF被認(rèn)為與鼻竇炎的難治性密切相關(guān)。一些專家特別指出,對于BBF相關(guān)性鼻竇炎治療措施的研究以及治療效果的評價應(yīng)針對S. aureus形成的BBF。研究表明,納米銀對浮游菌及其生物膜均具有強(qiáng)大的殺滅作用,近年來納米銀產(chǎn)品在臨床上的應(yīng)用越來越多。目前納米銀產(chǎn)品的制備主要是通過化學(xué)還原的方法,過程復(fù)雜且常需添加有毒試劑作為化學(xué)反應(yīng)的還原劑和納米銀顆粒的穩(wěn)定劑。對于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中應(yīng)用的納米銀產(chǎn)品,人們越來越多的關(guān)注于產(chǎn)品制備過程中的無毒、無害,即“綠色化學(xué)”。研究表明,與生物材料聚合既能減少納米銀顆粒的氧化、聚沉,又能增加其生物相容性,特別是一些天然生物大分子物質(zhì)不但對金屬有一定親和力而且在合適的溶劑中是可溶的。作為天然生物大分子,絲素蛋白具有良好的生物相容性,能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和黏膜的修復(fù),同時還能還原某些金屬離子生成納米金屬顆粒而負(fù)載于絲素蛋白中。但是利用絲素蛋白制備納米銀并將其應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究目前尚屬空白。因此,本研究的目的：1.根據(jù)“綠色化學(xué)”的理念制備出絲素蛋白-納米銀(silkfibroin-nano silver, SF-NS)溶液。2.以S. aureus為目標(biāo)菌種,觀察SF-NS溶液的抗菌性能和抗BBF活性,探討其潛在的臨床應(yīng)用價值。3.以S. aureus為致病菌建立BBF相關(guān)性鼻竇炎動物模型,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察SF-NS溶液局部沖洗對S. aureus生物膜相關(guān)性鼻竇炎的作用以及對鼻黏膜炎癥的影響。二、材料與方法本課題分為四部分。第一部分：SF-NS溶液的制備和表征。利用絲素蛋白分子中酪氨酸的還原能力,在室溫、光照條件下原位還原AgN03制備SF-NS溶液,并利用熒光光譜儀、紫外-可見分光光度儀(UV-visible spectrophotometer, UV-vis)和透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)等對反應(yīng)過程和產(chǎn)物進(jìn)行表征,明確絲素蛋白的還原能力、反應(yīng)體系的動力學(xué)指標(biāo)以及所形成納米銀顆粒的形貌學(xué)特征。第二部分：SF-NS溶液對S. aureus及其生物膜的作用。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的操作,采用肉湯稀釋法對臨床篩選的BBF陽性菌株和質(zhì)控菌ATCC 29213進(jìn)行最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)檢測。然后,通過剛果紅實(shí)驗(yàn)觀察SF-NS溶液對S. aureus形成BBF的影響,再通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)和共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)觀察SF-NS對成熟BBF的影響,明確不同濃度SF-NS對S. aureus及其生物膜的作用。第三部分：建立S. aureus生物膜相關(guān)性鼻竇炎動物模型。選取健康、體重2.5-3.5kg的新西蘭大白兔45只,隨機(jī)分為9組(其中4個模型組,4個陰性對照組,1個空白對照組),每組5只。模型組動物通過在右側(cè)上頜竇前外側(cè)壁鉆孔并經(jīng)此小孔向上頜竇內(nèi)置入明膠海綿和BBF陽性菌菌懸液的方法造模；陰性對照組動物只進(jìn)行右側(cè)上頜竇前外側(cè)壁鉆孔并經(jīng)此小孔向上頜竇內(nèi)留置明膠海綿,但不植入菌懸液；空白對照組動物不進(jìn)行任何處理。4個模型組和4個陰性對照組分別于術(shù)后1、2、4、8周時處死并采集上頜竇黏膜標(biāo)本,空白對照組動物在整個實(shí)驗(yàn)結(jié)束時處死。通過HE染色和SEM觀察造模后各時間點(diǎn)上頜竇黏膜的組織學(xué)特征和黏膜表面BBF的形成情況。第四部分：SF-NS溶液對S. aureus生物膜相關(guān)性鼻竇炎的作用。選取健康新西蘭大白兔30只,體重2.5-3.5kg,隨機(jī)分為5組,每組6只。A組：空白對照組,健康新西蘭大白兔,不進(jìn)行任何處理。B組：單純造模組,建立BBF相關(guān)性鼻竇炎動物模型,不進(jìn)行任何治療。C組：生理鹽水沖洗組,建立BBF相關(guān)性鼻竇炎動物模型,通過上頜竇置管用生理鹽水沖洗上頜竇,每天2次,每次2mL,連續(xù)沖洗1周。D組和E組：SF-NS溶液沖洗組,建立BBF相關(guān)性鼻竇炎動物模型,通過上頜竇置管分別用2xMBC和5×MBC濃度SF-NS溶液沖洗上頜竇,每天2次,每次2mL,連續(xù)沖洗1周。通過HE染色、SEM、RT-PCR和Western-blot檢測觀察不同處理組動物上頜竇黏膜的組織學(xué)特點(diǎn)、BBF數(shù)量以及炎性因子表達(dá)水平的變化,探討SF-NS溶液對S. aureus生物膜相關(guān)性鼻竇炎作用。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。三、結(jié)果：第一部分1 熒光光譜儀檢測結(jié)果顯示,在1%的絲素蛋白溶液中,當(dāng)AgN03濃度在0-8mg/mL范圍內(nèi)時,反應(yīng)體系中的絲素蛋白對Ag+具有充足的還原能力。2 UV-vis檢測結(jié)果表明在1%的絲素蛋白溶液中,當(dāng)AgNO3濃度為4mg/mL時,在室溫、光照條件下反應(yīng)20h時反應(yīng)體系達(dá)到了一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),并出現(xiàn)了納米銀顆粒的特征峰,進(jìn)一步延長反應(yīng)時間對納米銀的形成幾乎沒有影響。3 TEM檢測顯示,在以上反應(yīng)體系中形成了粒徑為12±2.1nm的納米顆粒,高分辨率TEM檢測表明所得產(chǎn)物為納米銀顆粒。4 通過以上反應(yīng)形成的SF-NS溶液在室溫下靜置30天后(無論避光與否),溶液的顏色、性狀和UV-vis檢測曲線均未發(fā)生任何變化。第二部分1 無論是對于BBF陽性菌Sa006,還是質(zhì)控菌ATCC29213, SF-N S的MIC和MBC均分別為19.8 mg/L和79.4mg/L。2 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1/4×MIC濃度的SF-NS能使Sa006形成的BBF明顯減少；1/2×MIC濃度的SF-NS能完全抑制BBF的形成,但對Sa006的增殖無明顯影響；MIC濃度的SF-NS能完全抑制Sa006的增殖。3 CLSM和SEM檢測表明,MIC濃度的SF-NS對成熟BBF的結(jié)構(gòu)以及其內(nèi)部細(xì)菌的活力均無明顯影響；隨著SF-NS濃度的進(jìn)一步增加,BBF的結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的破壞,當(dāng)SF-NS的濃度為5×MBC時,生物膜結(jié)構(gòu)被徹底破壞。第三部分1. 造模后模型組動物右側(cè)前鼻孔均出現(xiàn)黃色膿涕,陰性對照組僅有8只出現(xiàn)少量清涕。在術(shù)后各時間點(diǎn),模型組動物右側(cè)上頜竇內(nèi)均有膿性分泌物積存,對照組動物上頜竇內(nèi)均無積膿。2.CT掃描顯示,在造模后各時間點(diǎn),所有模型組動物的右側(cè)上頜竇內(nèi)均充滿軟組織密度影,而陰性對照組動物僅在術(shù)后第1、2周時存在右側(cè)上頜竇軟組織密度影。正常對照組動物CT檢測均未發(fā)現(xiàn)上頜竇內(nèi)病變。3.HE染色結(jié)果顯示,模型組動物上頜竇黏膜腫脹,黏膜層中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤,而陰性對照組僅在術(shù)后1周和2周時有少量的炎性細(xì)胞浸潤,術(shù)后4周和8周時黏膜的組織學(xué)特征基本恢復(fù)正常。4.SEM檢測發(fā)現(xiàn),在造模術(shù)后2、4、8周時,所有模型組動物的上頜竇黏膜表面均有BBF存在和不同程度的黏膜上皮損傷,而陰性對照組動物在術(shù)后各時間點(diǎn)黏膜上皮的完整性始終存在且均未發(fā)現(xiàn)BBF形成。第四部分1 SEM檢測結(jié)果顯示,A組上皮結(jié)構(gòu)完整,纖毛排列整齊。B組與C組黏膜表面存在大量BBF,上皮結(jié)構(gòu)破壞、纖毛結(jié)構(gòu)缺失；D組黏膜表面仍存在少量的BBF,但上皮結(jié)構(gòu)基本完整,部分上皮細(xì)胞表面有纖毛生長；E組黏膜表面未發(fā)現(xiàn)BBF,上皮結(jié)構(gòu)完整,多數(shù)上皮細(xì)胞表面已經(jīng)有新生纖毛形成。2 HE染色結(jié)果顯示,A組表現(xiàn)為典型的假復(fù)層纖毛柱狀上皮,黏膜層中無明顯炎性細(xì)胞浸潤；B組與C組上皮層明顯破壞或缺失,黏膜層中大量炎性細(xì)胞浸潤；D組上皮層雖然存在但細(xì)胞排列紊亂,黏膜層中仍有大量炎性細(xì)胞浸潤；E組上皮層結(jié)構(gòu)基本正常,但黏膜層中仍有較多的炎性細(xì)胞浸潤。3 在RNA表達(dá)水平,與A組相比,B組IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α的表達(dá)顯著增多,而IL-4、IL-5的表達(dá)顯著減少。與B組相比：C組各炎性因子的表達(dá)均無明顯變化；D組IL-1β的表達(dá)顯著增多,而IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、TNF-α的表達(dá)無明顯變化；E組IL-4、IL-5、IL-10的表達(dá)顯著增多,IL-8的表達(dá)顯著減少,IL-1β、TNF-α的表達(dá)無明顯差異。與C相比：D組IL-1p的表達(dá)增加,IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、TNF-α的表達(dá)均無顯著差異；E組IL-4、IL-5、IL-10的表達(dá)增加,IL-8的表達(dá)減少,IL-1β、TNF-α的表達(dá)無顯著差異。4 在蛋白質(zhì)表達(dá)水平,與A組相比,B組IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α的表達(dá)均顯著增加。與B組相比：C組TNF-α的表達(dá)明顯減少,IL-1β、IL-8、IL-10的表達(dá)均無明顯差異；D組IL-1β的表達(dá)顯著增多,TNF-α的表達(dá)明顯減少,而IL-8、IL-10的表達(dá)均無明顯差異；E組IL-8、TNF-α的表達(dá)顯著減少,1L-1β、IL-10的表達(dá)無明顯差異。與C組相比：D組IL-1β表達(dá)增加,IL-8、IL-10、TNF-α的表達(dá)無顯著差異；E組IL-1β、IL-10的表達(dá)顯著增加,IL-8、TNF-α的表達(dá)顯著減少。四、結(jié)論：1 絲素蛋白能夠在室溫、光照條件下原位還原AgN03形成SF-NS溶液,所形成的納米銀粒徑較為均勻,且能在常溫下長期保持穩(wěn)定。絲素蛋白在這一反應(yīng)體系中不但起到了還原劑的作用,同時也起到了穩(wěn)定劑的作用。2 SF-NS溶液對S. aureus具有良好的殺菌作用,并且在較低濃度時能抑制S. aureus生物膜的形成,在較高濃度時能夠破壞成熟的BBF,效應(yīng)呈濃度依賴性。3 以新西蘭大白兔為模型動物,通過上頜竇前壁鉆孔,在上頜竇內(nèi)留置可吸收性明膠海綿并注入BBF陽性S. aureus的方法建立起的BBF相關(guān)性鼻竇炎動物模型,方法簡單易行且結(jié)果可靠。4 S. aureus形成的BBF導(dǎo)致鼻黏膜發(fā)生了Th1/Th2雙向失衡的炎癥反應(yīng)(Thl類炎性因子表達(dá)增多、Th2類炎性因子表達(dá)減少)。SF-NS溶液不但能徹底清除鼻黏膜上的BBF,而且能促進(jìn)病變黏膜的組織修復(fù)和炎性因子表達(dá)的良性轉(zhuǎn)歸。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R765.41

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本文編號：1554094