本文關(guān)鍵詞： Behcet病 Vogt-小柳原田綜合征 肝X受體 Th17細(xì)胞 Th1細(xì)胞　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 葡萄膜炎是一組累及葡萄膜、玻璃體、視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜血管的炎癥，也被稱為眼內(nèi)炎癥。由于葡萄膜炎的發(fā)病部位或累及組織不同，在臨床上類型眾多。如根據(jù)病因可分為感染性、外傷性、自身免疫性葡萄膜炎等，根據(jù)炎癥所在位置可分為前、中間、后及全葡萄膜炎，而根據(jù)與全身性疾病的關(guān)聯(lián)又可分為Fuchs綜合征、Behcet�。˙ehcet’sdisease，BD）、Vogt-小柳原田綜合征（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）等。Behcet病是一種以葡萄膜炎、多形性皮膚損害、口腔潰瘍、生殖器潰瘍等為特征的多器官、多系統(tǒng)受累的疾病。Vogt-小柳原田病也是一種累及全身多個系統(tǒng)的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為脈絡(luò)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、視乳頭炎、神經(jīng)視網(wǎng)膜炎和肉芽腫性全葡萄膜炎，常伴有皮膚和毛發(fā)改變、聽覺功能障礙、腦膜刺激征等全身性表現(xiàn)。該兩種疾病所致的葡萄膜炎均受累組織廣泛、發(fā)作頻繁、治療困難、預(yù)后差，屬葡萄膜炎中處理最為棘手的類型范疇，也屬我國葡萄膜炎中常見類型范疇[1]。它們的病因和發(fā)病機(jī)制均尚不完全清楚，目前有細(xì)菌感染學(xué)說、病毒感染學(xué)說、自身免疫學(xué)說等多種學(xué)說。自身免疫學(xué)說是目前廣為人們所接受的一種學(xué)說，研究較多也較明確的自身免疫因素便是CD4+T細(xì)胞包括Th17、Th1、Treg細(xì)胞，及一些炎癥因子包括IL-17、IFN-γ、IL-10等[2-11]。肝X受體（liver X receptor, LXR）是核受體的一種，對其功能的報(bào)道早年主要是關(guān)于脂質(zhì)代謝方面[12]，近期越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥及免疫調(diào)節(jié)上有重要的作用，如對CD4+T細(xì)胞及多種炎癥因子有調(diào)節(jié)作用[13-15]。肝X受體活化的激動劑有內(nèi)源性氧化膽固醇衍生物包括22（R）-羥固醇、24（S）-羥固醇、27-羥固醇等，和合成激動劑如T0901317、GW3965[16-20]。 因此我們進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1.肝X受體在Behcet病患者中表達(dá)水平的研究；2.肝X受體在Vogt-小柳原田綜合征患者中表達(dá)水平的研究；3. GW3965對CD4+T細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制的研究。從而研究肝X受體會不會是引起B(yǎng)ehcet病或Vogt-小柳原田病發(fā)病的重要因素，為這類難治、易復(fù)發(fā)的棘手疾病的治療提供新的方向和思路。 第一部分肝X受體在Behcet病患者中表達(dá)水平的研究 目的： 研究肝X受體在Behcet病患者中的表達(dá)水平及其與疾病活動性的相關(guān)性。 方法： 將從正常人和Behcet病患者（包括疾病活動程度為活動期和靜止期的患者）靜脈新鮮抽取的外周血進(jìn)行密度梯度離心，以分離外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。提取PBMCs的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)時熒光定量PCR（Polymerase chainreaction）（RT-qPCR）的方法檢測PBMCs中LXR的表達(dá)。對分離出的PBMCs使用人CD4+T細(xì)胞磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選，收集CD4+T細(xì)胞。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測正常人及病人CD4+T細(xì)胞中LXR的表達(dá)。 結(jié)果： 1.活動期Behcet病患者LXRβ在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)及在純化的CD4+T細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)均顯著低于正常人。 2.靜止期Behcet病患者LXRβ在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)及在純化的CD4+T細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)均與正常人無明顯差異。 3. Behcet病患者（包括疾病活動程度為活動期和靜止期的患者）LXRα在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)及在純化的CD4+T細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)均與正常人無明顯差異。 結(jié)論： 我們的研究表明：Behcet病葡萄膜炎患者PBMCs中LXRβ的mRNA的表達(dá)低于正常對照，純化的CD4+T細(xì)胞中LXRβ的蛋白的表達(dá)亦低于正常對照。說明與正常人相比，LXRβ的表達(dá)在BD病人中存在差異，提示與疾病存在相關(guān)性。另一亞型LXRα在PBMCs與CD4+T細(xì)胞水平均無改變。LXR的表達(dá)只在眼部炎癥活動期的葡萄膜炎患者中降低，而在靜止期則不然，表明其與該病的疾病發(fā)展存在某種關(guān)聯(lián)。 第二部分肝X受體在Vogt-小柳原田綜合征患者中表達(dá)水平的研究 目的： 研究肝X受體在Vogt-小柳原田綜合征患者中的表達(dá)水平及其與疾病活動性的相關(guān)性。 方法： 將從正常人和Vogt-小柳原田綜合征患者（包括疾病活動程度為活動期和靜止期的患者）靜脈新鮮抽取的外周血進(jìn)行密度梯度離心，以分離PBMCs。用人CD4+T細(xì)胞磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選，收集CD4+T細(xì)胞。用RT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)檢測LXR的表達(dá)。結(jié)果： 1.活動期Vogt-小柳原田綜合征患者LXRβ在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)顯著低于正常人，靜止期患者的表達(dá)則無明顯差異。 2.活動期和靜止期的Vogt-小柳原田綜合征患者LXRβ在純化的CD4+T細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)均與正常人無顯著差異。 3. Vogt-小柳原田綜合征患者（包括疾病活動程度為活動期和靜止期的患者）LXRα在PBMCs中mRNA水平的表達(dá)及在純化的CD4+T細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)均與正常人無明顯差異。 結(jié)論： 第一部分和第二部分的結(jié)果表明：Behcet病和Vogt-小柳原田綜合征患者PBMCs中LXRβ的mRNA的表達(dá)均低于正常對照，提示與疾病存在相關(guān)性。Behcet病患者中純化的CD4+T細(xì)胞中LXRβ蛋白的表達(dá)亦低于正常對照，而Vogt-小柳原田綜合征患者則與正常無差異，分析可能是PBMCs中LXRβ的低表達(dá)主要不存在于CD4+T細(xì)胞中而是PBMC中的其他種類細(xì)胞。 第三部分GW3965對CD4+T細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制的研究 目的： 肝X受體在免疫調(diào)節(jié)中的作用尚不完全清楚。本部分研究探討LXR對CD4+T細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制，從而明確LXR在BD和VKH疾病發(fā)病中的作用。 方法： 將從正常人和患者（包括活動期Behcet病和活動期Vogt-小柳原田綜合征患者）靜脈新鮮抽取的外周血進(jìn)行密度梯度離心，以分離PBMCs。用人CD4+T細(xì)胞磁珠進(jìn)行細(xì)胞分選，收集CD4+T細(xì)胞。用流式細(xì)胞技術(shù)和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）的方法檢測LXR對CD4+T細(xì)胞功能的影響。用RT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)研究LXR激動劑GW3965對CD4+T細(xì)胞作用的機(jī)制。 結(jié)果： 1. GW3965抑制CD4+T細(xì)胞對IL-17、IFN-γ的分泌，對IL-10的產(chǎn)生無影響。 2. GW3965降低IL-17+、IFN-γ+和IL-17IFN-γ雙陽Th細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，對Treg細(xì)胞的百分比無影響。 3. GW3965抑制轉(zhuǎn)錄因子RORC和T-bet在mRNA水平的表達(dá)。 4. GW3965抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，對CD4+T細(xì)胞的凋亡無明顯影響。 5.在刺激30min時，GW3965顯著地降低CD4+T細(xì)胞中Nfκ（bNuclearFactor κB，核因子κB） p65(pS529)的磷酸化水平。 6.肝X受體的活化伴有載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）在mRNA水平表達(dá)的上調(diào)。 結(jié)論： 結(jié)果表明，GW3965可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、Nfκb炎癥信號通路等機(jī)制發(fā)揮對CD4+T細(xì)胞功能的影響，包括各類效應(yīng)細(xì)胞的百分比、細(xì)胞因子的分泌、增殖、凋亡等。提示LXR的活化可通過抑制Th1和Th17細(xì)胞的效應(yīng)來發(fā)揮對異常免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的作用。
[Abstract]:background
Uveitis is a group of uveal involvement, vitreous body, retina and retinal vascular inflammation, also known as intraocular inflammation. Due to the different incidence of uveitis or involvement in clinical tissue, many types. Such as according to the etiology can be divided into traumatic, infectious, autoimmune uveitis, according to lesion location can be as before, the middle, and panuveitis, according to associated with systemic diseases can be divided into Fuchs syndrome, Behcet disease (Behcet sdisease, BD), Vogt- Liu Yuantian syndrome (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome, VKH.Behcet) is a kind of disease with uveitis, pleomorphic skin lesions, oral ulcer multiple organ, genital ulcers and other characteristics, inflammatory disease multisystem disease of.Vogt- Koyanagi Harada disease is a multisystemic, mainly for choroiditis, chorioretinitis, Papillitis, neuroretinitis and granulomatous panuveitis, often accompanied by skin and hair changes, auditory dysfunction, systemic symptoms and meningeal irritation. The two kinds of diseases caused by uveitis were involved in organization wide, frequent attacks, treatment difficulties, poor prognosis, is in the category of types of uveitis is tricky, too is our common etiology and pathogenesis of uveitis with different types of [1]. they are still not completely clear, at present there is a bacterial infection theory, virus infection theory, autoimmune theory and other theories. The immunity theory is a widely accepted theory, autoimmune factors have more clear and research CD4+T cells including Th17, Th1, Treg cells and some inflammatory factors including IL-17, IFN- gamma, IL-10 [2-11]. (liver X receptor liver X receptor, LXR) is a nuclear receptor, on its function Early reports mainly on lipid metabolism of [12], more and more recent researches found in inflammation and immunity plays an important role in regulation, such as regulation of [13-15]. activation of liver X receptor agonists have endogenous oxidation of cholesterol derivatives including 22 on CD4+T cells and inflammatory factor (R) - hydroxy steroid, 24 (S) - hydroxy steroid, 27- hydroxyl steroids, and synthetic agonists such as T0901317, GW3965[16-20].
Therefore, we carried out the following experiments: the expression level of liver X receptor in 1. patients with Behcet disease; 2. liver X receptors in the Vogt- Liu Yuantian syndrome study on the expression level of patients in the study; 3. GW3965 effect on CD4+T cell function and its mechanism. To study the liver X receptor may be an important factor in causing Behcet disease or Vogt- Vogt Koyanagi Harada disease, such as refractory, provide new direction and ideas for easy difficult disease recurrence.
Study on the expression level of liver X receptor in patients with Behcet disease in the first part
Objective:
To study the expression level of liver X receptor in patients with Behcet disease and its correlation with the activity of disease.
Method錛

本文編號：1546294