本文關(guān)鍵詞： CADM2 增殖 細(xì)胞周期阻滯 抑癌基因　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鼻咽癌是一種低分化、高侵襲性的腫瘤，惡性程度非常高。它在我國(guó)廣東省中部地區(qū)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其在東南亞、北非和中東部分地區(qū)也屬高發(fā)腫瘤。目前我國(guó)各地的鼻咽癌發(fā)病率逐年上升，加強(qiáng)對(duì)其進(jìn)行預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)和治療迫在眉睫。在發(fā)病機(jī)制上，目前認(rèn)為EB病毒、遺傳易感性、飲食和環(huán)境因素等是誘發(fā)鼻咽癌的幾大重要因素。這些因素單獨(dú)或聯(lián)合作用，可導(dǎo)致多個(gè)基因和表觀遺傳學(xué)的改變，其中抑癌基因的失活或表達(dá)缺失與鼻咽癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系，但鼻咽癌的分子發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。鼻咽癌的初發(fā)癥狀不明顯，發(fā)生部位較為隱蔽，給臨床的診斷和治療上帶來(lái)了極大的困難，多數(shù)病人在確診時(shí)已為中、晚期且常伴有轉(zhuǎn)移。目前鼻咽癌的主要治療方法為放射治療，治療后五年生存率低于60%。因此迫切需要我們進(jìn)一步闡明鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制、挖掘有價(jià)值的用于早期診斷和治療的生物靶標(biāo)。 CADMs（Cell Adherin Molecules）家族屬于免疫球蛋白超家族，目前發(fā)現(xiàn)由4個(gè)成員組成，包括CADM1、CADM2、CADM3和CADM4。該家族4個(gè)分子在結(jié)構(gòu)上非常相似，均由3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域、單次跨膜區(qū)域和一個(gè)含有蛋白4.1作用序列和II型PDZ基序的短胞漿區(qū)組成。據(jù)報(bào)道CADMs家族成員通過(guò)Ig樣結(jié)構(gòu)域來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附，從而影響細(xì)胞生物學(xué)行為；其胞內(nèi)段蛋白4.1結(jié)合基序和II型PDZ基序可與相應(yīng)的配體結(jié)合，參與細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)等。近年來(lái)，有關(guān)這個(gè)家族的研究越來(lái)越多，但主要集中在對(duì)CADM1的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中（包括小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌和胃癌等）發(fā)現(xiàn)CADM1普遍存在啟動(dòng)子甲基化和表達(dá)下調(diào)，且CADM1的表達(dá)缺失與腫瘤的惡性程度、病理分級(jí)分期密切相關(guān)。在功能上發(fā)現(xiàn)CADM1在多種腫瘤細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移的作用，且在上皮細(xì)胞、干細(xì)胞靜息和損傷修復(fù)等方面也發(fā)揮著重要的作用。而在血液系統(tǒng)腫瘤研究中，CADM1的表達(dá)下調(diào)促使腫瘤細(xì)胞易于逃脫宿主系統(tǒng)的免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。該家族其他分子如CADM3和CADM4也被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)或缺失，表明它們與腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)。 近年來(lái)，CADMs家族另一個(gè)分子CADM2的表達(dá)與功能越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)CADM2在前列腺癌、腎癌和肝癌等腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)與甲基化相關(guān)，提示CADM2可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而CADM2在與鼻咽癌中的表達(dá)及其作用還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文將通過(guò)檢測(cè)CADM2在鼻咽癌中的表達(dá)，闡明CADM2基因在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其作用的分子機(jī)制。 在本課題中，我們首先通過(guò)半定量PCR方法檢測(cè)CADM2在多種鼻咽癌細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平。構(gòu)建攜帶CADM2基因的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，感染CADM2低表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞，再通過(guò)細(xì)胞倍增、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、平板克隆、非錨著依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（軟瓊脂平板克�。┑确治鯟ADM2基因的過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力的影響，，進(jìn)一步通過(guò)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CADM2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力的影響。為便于檢測(cè)臨床組織標(biāo)本中CADM2的表達(dá)，成功制備了抗CADM2的特異性鼠單克隆抗體。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CADM2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期的影響，通過(guò)Western blot和細(xì)胞免疫熒光等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)。構(gòu)建CADM2的多個(gè)結(jié)構(gòu)缺失體，明確其發(fā)揮作用的相關(guān)結(jié)構(gòu)域。最后通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)CADM2與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p-Akt、p27KIP1和p21WAF1/CIP1在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)相關(guān)性。 通過(guò)本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)CADM2在多種鼻咽癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。在鼻咽癌細(xì)胞HONE1和HNE1中，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CADM2可延長(zhǎng)鼻咽癌細(xì)胞的倍增時(shí)間、抑制細(xì)胞增殖；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CADM2可抑制鼻咽癌細(xì)胞的克隆形成、非錨著依賴性生長(zhǎng)及裸鼠體內(nèi)成瘤等能力。在機(jī)制研究中我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CADM2可介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯。通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CADM2可抑制p-Akt的活性，上調(diào)細(xì)胞周期激酶抑制因子p27KIP1和p21WAF1/CIP1的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期進(jìn)展因子CDK2、CyclinE、Skp2的表達(dá)，最終發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯的作用。通過(guò)CADM2缺失體研究我們還發(fā)現(xiàn)CADM2的細(xì)胞膜定位依賴于其胞外段，從而發(fā)揮其細(xì)胞周期阻滯作用。最后通過(guò)IHC檢測(cè)臨床鼻咽癌組織標(biāo)本，證實(shí)鼻咽癌組織中存在CADM2的表達(dá)下調(diào)，與p-Akt表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與p27KIP1和p21WAF1/CIP1表達(dá)及細(xì)胞核定位有關(guān)，預(yù)示著CADM2的表達(dá)在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。 我們的結(jié)果首次闡明了CADM2在鼻咽癌中呈表達(dá)下調(diào)或缺失，參與調(diào)節(jié)PI3K/Akt/p27KIP1、p21WAF1/CIP1信號(hào)通路介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，從而抑制了鼻咽癌的生長(zhǎng)，揭示了一種新的鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1538267