本文關(guān)鍵詞： 斑馬魚 側(cè)線發(fā)育 毛細(xì)胞再生 組蛋白甲基化 表觀遺傳學(xué)　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：噪聲、耳毒性藥物和衰老等因素導(dǎo)致人類內(nèi)耳機(jī)械能感受細(xì)胞毛細(xì)胞的損傷和缺失,是導(dǎo)致獲得性感音神經(jīng)性耳聾的主要原因。和低等的脊椎動(dòng)物如魚類、禽類不同,哺乳類動(dòng)物毛細(xì)胞損傷缺失后不能夠自發(fā)性再生,將導(dǎo)致不可逆的聽力損失。因此毛細(xì)胞再生調(diào)控成為了治療感音神經(jīng)性耳聾的終極靶標(biāo)。但是由于內(nèi)耳毛細(xì)胞深埋于頭顱顳骨中,標(biāo)本獲取和處理困難較大,并且不易直接觀察,為毛細(xì)胞發(fā)育和再生調(diào)控研究帶來了困難。 側(cè)線是位于魚類體表感知水流和壓力變化的機(jī)械感受器,它是由一組相對(duì)獨(dú)立的神經(jīng)丘組成,位于神經(jīng)丘中央的機(jī)械感受器毛細(xì)胞以及位于周邊的非感覺支持細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)丘的基本結(jié)構(gòu)。側(cè)線毛細(xì)胞如內(nèi)耳毛細(xì)胞一樣來自始基,具有相似的發(fā)育和分化立體模式、相似的的結(jié)構(gòu)以及功能調(diào)控機(jī)制,由于斑馬魚側(cè)線器位于體表,便于活體觀察毛細(xì)胞,成為了研究毛細(xì)胞再生的經(jīng)典模型。但在不同的發(fā)育時(shí)期毛細(xì)胞再生可能受到側(cè)線器毛細(xì)胞發(fā)育及自我修復(fù)的影響,因此研究不同發(fā)育時(shí)期毛細(xì)胞再生能力及規(guī)律非常重要。 機(jī)械感受器的發(fā)生(如內(nèi)耳器官發(fā)生、神經(jīng)丘發(fā)育)涉及到細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和分化過程,需要嚴(yán)格的時(shí)間和空間調(diào)控以產(chǎn)生相互作用的特定數(shù)目、分布和分化狀態(tài)的細(xì)胞。在此過程中特定基因的有序表達(dá)和功能調(diào)控具有重要的意義,因此以可遺傳的基因表達(dá)調(diào)控信息傳遞為主要研究內(nèi)容的表觀遺傳學(xué)成為了器官發(fā)生研究的熱點(diǎn)問題。 “組蛋白密碼”是其重要部分,核小體組蛋白上的共價(jià)修飾,在真核細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和基因表達(dá)調(diào)控方面起重要作用。組蛋白甲基化作為一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素,被認(rèn)為在基因表達(dá)的抑制或者活化、以及染色體結(jié)構(gòu)域中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 研究表明,在細(xì)胞核內(nèi),組蛋白甲基化和去甲基化過程處于動(dòng)態(tài)平衡,兩過程分別由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶催化。常染色質(zhì)組蛋白單-,雙-甲基化主要由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase)催化,組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a主要作用于H3K9的單-、雙-甲基化。 有研究顯示G9a調(diào)控的H3K9甲基化是細(xì)胞分化的必要條件。G9a缺陷小鼠胚胎及其胚胎干細(xì)胞中甲基化H3K9急劇下降,其研究結(jié)果表明G9a調(diào)節(jié)常染色體H3K9的甲基化,其為早期胚胎發(fā)育所必需且參與發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制。在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞早期分化中,H3K9me2的可以檢測到,但出生后消失,提示H3K9me2參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育。H3K9me2在內(nèi)耳發(fā)育及毛細(xì)胞再生過程中是否發(fā)揮生理作用目前尚不清楚,我們以斑馬魚側(cè)線器為模型,研究H3K9me2與毛細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育及再生的關(guān)系。 第一部分斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?目的 建立研究斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?定量研究神經(jīng)丘發(fā)育過程中細(xì)胞增殖及毛細(xì)胞分化過程,為神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?材料和方法 選擇野生型AB品系斑馬魚,在3dpf-7dpf的發(fā)育過程中以活細(xì)胞染料FM1-43FX以及MyosinⅥ標(biāo)記毛細(xì)胞,BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞,觀察神經(jīng)丘的增殖及毛細(xì)胞的分化過程。合成地高辛標(biāo)記fgfrl, atohla的反義RNA探針,進(jìn)行斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交,研究fgfrl和atohla mRNA在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的表達(dá)情況。 結(jié)果 1.3dpf-7dpf斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育分化的關(guān)鍵時(shí)期：以FM1-43FX標(biāo)記的毛細(xì)胞在幼魚孵育出來前己出現(xiàn),隨著時(shí)間推移,毛細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。3dpf為4.100±0.2049(n=6),4dpf為5.386±0.1809(n=14),5dpf為8.467±0.3528(n=6),7dpf為9.225±0.4061(n=8)。Student's t-test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：3dpf vs4dpf, P值=0.0006；4dpf vs5dpf,P值0.0001,差異具有顯著性。5dpf vs7dpf, P值=0.2017,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.3dpf~7dpf斑馬魚神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細(xì)胞繼續(xù)增加：BrdU陽性標(biāo)記見于神經(jīng)丘周邊區(qū)支持細(xì)胞細(xì)胞核,毛細(xì)胞細(xì)胞核陽性標(biāo)記少見。5dpf神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細(xì)胞數(shù)目2.300±0.3222(n=6),7dpf神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細(xì)胞4.333±0.4244(n=6)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示P=0.0003,二者差異有顯著性。 3. fgfrl、atohla在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的表達(dá)：FGFR mRNA在神經(jīng)丘的發(fā)育 過程中表達(dá),證實(shí)FGF信號(hào)通路參與神經(jīng)丘的發(fā)育；側(cè)線器毛細(xì)胞前體細(xì)胞在分化為毛細(xì)胞時(shí)表達(dá)atohla,我們的研究顯示5dpf斑馬魚神經(jīng)丘中atohlamRNA表達(dá)于神經(jīng)丘中央?yún)^(qū),7dpf時(shí)atohla表達(dá)降至低水平。由于神經(jīng)丘毛細(xì)胞此后繼續(xù)再生,atohla陽性毛細(xì)胞前體細(xì)胞仍將繼續(xù)存在,進(jìn)一步證實(shí)了atohla參與毛細(xì)胞分化及再生的過程。 結(jié)論 1.成功建立了研究斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?2.建立斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)方法； 3.定量研究了發(fā)育過程中神經(jīng)丘前體細(xì)胞增殖和毛細(xì)胞分化,為后期實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 第二部分斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生實(shí)驗(yàn)研究 目的 定量研究在不同發(fā)育階段神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生能力,觀察最佳的研究神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生的時(shí)間窗,建立斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?材料和方法 選擇野生型AB品系斑馬魚,以活細(xì)胞染料FM1-43FX以及MyosinVI標(biāo)記毛細(xì)胞,BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞。新霉素處理3dpf,5dpf,7dpf斑馬魚,觀察損傷后即刻、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)毛細(xì)胞損傷及恢復(fù)情況；合成地高辛標(biāo)記c-mycb, odcl的反義RNA探針,進(jìn)行斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交,研究c-mycb, odcl mRNA在新霉素處理1小時(shí)后神經(jīng)丘中的表達(dá)情況。 結(jié)果 1.細(xì)胞凋亡是新霉素介導(dǎo)的神經(jīng)丘毛細(xì)胞死亡的主要方式：以FM1-43FX活體染料(紅色)標(biāo)記毛細(xì)胞后,予新霉素處理1小時(shí)后固定觀察——位于神經(jīng)丘中央?yún)^(qū)向心性聚集的毛細(xì)胞消失,神經(jīng)丘外周區(qū)域可見多個(gè)散在的紅色質(zhì)膜包繞的圓形固縮小核——凋亡小體,提示細(xì)胞凋亡是新霉素介導(dǎo)的神經(jīng)丘毛細(xì)胞死亡的主要方式。 2.不同發(fā)育階段神經(jīng)丘新霉素?fù)p傷后毛細(xì)胞再生的規(guī)律：3dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時(shí)毛細(xì)胞數(shù)目4.250±0.1794(n=12),5dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時(shí)毛細(xì)胞數(shù)目2.507±0.1433(n=15),7dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時(shí)毛細(xì)胞數(shù)目1.333±0.1491(n=9)；5dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)毛細(xì)胞數(shù)目分別為2.507±0.1433(n=15),3.900±0.2878(n=8),9.378±0.3307(n=9),損傷后72小時(shí)毛細(xì)胞數(shù)目達(dá)正常對(duì)照組87.5%。 3.新霉素?fù)p傷后神經(jīng)丘細(xì)胞增殖狀態(tài)：斑馬魚神經(jīng)丘在新霉素?fù)p傷后,BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目增多,但多位于外周支持細(xì)胞,新生毛細(xì)胞中少見。損傷后72小時(shí)FM1-43FX與BrdU共標(biāo)細(xì)胞占毛細(xì)胞總數(shù)的24.94%±3.75%。 4. c-mycb和odc1mRNA在新霉素?fù)p傷后神經(jīng)丘中的表達(dá)：新霉素?fù)p傷后毛細(xì)胞再生機(jī)制啟動(dòng),研究結(jié)果顯示c-mycb及其下游靶向odc-1在神經(jīng)丘表達(dá),且二者分布類似。 結(jié)論 1.系統(tǒng)研究了神經(jīng)丘發(fā)育不同階段毛細(xì)胞再生的規(guī)律,選擇5dpf斑馬魚進(jìn)行毛細(xì)胞再生研究,可剔除毛細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育的干擾,是研究毛細(xì)胞再生的最佳時(shí)間窗。 2.損傷后毛細(xì)胞的恢復(fù)多為直接轉(zhuǎn)分化而來,部分新生毛細(xì)胞源于細(xì)胞增殖再生。 3. c-mycb和odcl mRNA在新霉素處理后神經(jīng)丘表達(dá),提示兩者參與新霉素介導(dǎo)的毛細(xì)胞損傷后的修復(fù)過程,以及抗凋亡保護(hù)作用。 第三部分H3K9me2在正常神經(jīng)丘發(fā)育過程中的作用 目的 定量研究斑馬魚神經(jīng)丘發(fā)育過程中H3K9me2的表達(dá),探索H3K9me2在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的作用。 材料和方法 1.分別取3dpf,4dpf,5dpf,7dpf野生型斑馬魚作以下3標(biāo)免疫熒光染色： (1) FM1-43FX標(biāo)記毛細(xì)胞 (2) anti-H3K9me2 (3) DAPI 2.新霉素?fù)p傷后恢復(fù)72hrs后,作以下3標(biāo)免疫熒光染色： (1) FM1-43FX標(biāo)記毛細(xì)胞 (2)anti-H3K9me2 (3)DAPI 結(jié)果 1.神經(jīng)丘發(fā)育成熟過程中H3K9me2表達(dá)水平逐漸降低：H3K9me2在3dpf表達(dá)于神經(jīng)丘大部分細(xì)胞的細(xì)胞核中,4dpf隨著神經(jīng)丘毛細(xì)胞分化增多,H3K9me2僅散在表達(dá)于神經(jīng)丘外圍細(xì)胞；毛細(xì)胞分化過程中H3K9me2降低,毛細(xì)胞發(fā)育成熟后逐漸消失(7dpf)。不同發(fā)育階段的斑馬魚神經(jīng)丘中H3K9me2(+)細(xì)胞與FM1-43FX(+)細(xì)胞的比值3dpf:1,830±0.09815(n=4)；4dpf:1.195±0.03175(n=4)；5dpf:1.060±0.1097(n=4)；7dpf:0.6250±0.04907(n=4).統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：3dpf vs4dpf, P值=0.0008；4dpf vs5dpf, P值=0.2819；5dpf vs7dpf, P值=0.0111。3dpf和4dpf,5dpf和7dpf比值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.新霉素?fù)p傷后神經(jīng)丘H3K9me2表達(dá)增加：新霉素?fù)p傷后72小時(shí)神經(jīng)丘毛細(xì)胞已基本恢復(fù),花結(jié)形成,其外周亦可見較多H3K9me2陽性細(xì)胞。H3K9me2(+)細(xì)胞與FM1-43FX(+)細(xì)胞的比值1153±0.07204(n=4),與7dpf-正常對(duì)照組0.6250±0.04907(n=4)相比,P值=0.0009,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。 結(jié)論 1.H3K9me2參與神經(jīng)丘的發(fā)育過程,以及新霉素介導(dǎo)的毛細(xì)胞損傷的再生過程； 2.毛細(xì)胞分化過程中H3K9me2降低,毛細(xì)胞發(fā)育成熟過程中逐漸消失； 3.H3K9me2在增殖期神經(jīng)丘表達(dá)明顯,在成熟的毛細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),提示H3K9me2是維持神經(jīng)丘前體細(xì)胞特征的關(guān)鍵分子之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R764

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李華偉,汪吉寶;雛雞聽毛細(xì)胞損傷后c-myc mRNA及其產(chǎn)物表達(dá)的研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1999年04期

2 孫智慧;賈順姬;孟安明;;斑馬魚:在生命科學(xué)中暢游[J];生命科學(xué);2006年05期

，

本文編號(hào)：1517585