本文關(guān)鍵詞： 臍帶間充質(zhì)干細胞 流式細胞術(shù) 分化 綠色熒光蛋白 腺病毒 間充質(zhì)干細胞 鼻黏膜 放射性損傷 干細胞移植 條件培養(yǎng)液 旁分泌 分化 遷徙 趨化作用 β-Tubulin 共培養(yǎng)　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及熒光標記目的：探討分離,培養(yǎng),鑒定,熒光標記人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物學(xué)特性,為后期動物實驗及體外實驗做準備。方法：分別用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng),每3-4 d按照1：3比例傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),統(tǒng)計開始收獲原代(P0)細胞的時間和PO細胞的產(chǎn)量,CCK8法檢測細胞增殖能力,臺盼藍染色檢測凍存復(fù)蘇活細胞比例。通過觀察細胞貼壁能力,流式細胞術(shù)檢測細胞表型,體外成脂、成骨、成軟骨定向誘導(dǎo)檢測分化能力,鑒定其是否符合間充質(zhì)干細胞國際標準。用攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染hUC-MSCs標記細胞,流式細胞術(shù)檢測標記效率。結(jié)果：hUC-MSCs呈長梭形,貼壁生長,細胞密集時呈放射狀或漩渦狀排列。酶消化法細胞收獲PO細胞時間早于組織塊法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但產(chǎn)量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。兩種方法獲得細胞增殖能力,凍存復(fù)蘇活細胞比例無明顯差異。兩種方法獲得細胞都能在塑料培養(yǎng)容器上貼壁,流式檢測陽性表達率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在體外誘導(dǎo)環(huán)境下能向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞分化。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后可見較強綠色熒光,流式檢測GFP陽性率94.4%。結(jié)論：酶消化法和組織塊法均可獲得足量原代hUC-MSCs,通過細胞形態(tài),表型,成骨,成脂,成軟骨分化鑒定證明符合國際干細胞協(xié)會標準。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs具有效率高,熒光強的特點。第一部分人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及熒光標記目的：探討分離,培養(yǎng),鑒定,熒光標記人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物學(xué)特性,為后期動物實驗及體外實驗做準備。方法：分別用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng),每3-4 d按照1：3比例傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),統(tǒng)計開始收獲原代(P0)細胞的時間和PO細胞的產(chǎn)量,CCK8法檢測細胞增殖能力,臺盼藍染色檢測凍存復(fù)蘇活細胞比例。通過觀察細胞貼壁能力,流式細胞術(shù)檢測細胞表型,體外成脂、成骨、成軟骨定向誘導(dǎo)檢測分化能力,鑒定其是否符合間充質(zhì)干細胞國際標準。用攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染hUC-MSCs標記細胞,流式細胞術(shù)檢測標記效率。結(jié)果：hUC-MSCs呈長梭形,貼壁生長,細胞密集時呈放射狀或漩渦狀排列。酶消化法細胞收獲PO細胞時間早于組織塊法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但產(chǎn)量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。兩種方法獲得細胞增殖能力,凍存復(fù)蘇活細胞比例無明顯差異。兩種方法獲得細胞都能在塑料培養(yǎng)容器上貼壁,流式檢測陽性表達率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在體外誘導(dǎo)環(huán)境下能向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞分化。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后可見較強綠色熒光,流式檢測GFP陽性率94.4%。結(jié)論：酶消化法和組織塊法均可獲得足量原代hUC-MSCs,通過細胞形態(tài),表型,成骨,成脂,成軟骨分化鑒定證明符合國際干細胞協(xié)會標準。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs具有效率高,熒光強的特點。第二部分hUC-MSCs修復(fù)豚鼠鼻黏膜放射性損傷的效果目的：檢測hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻對豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型的治療效果。方法：構(gòu)建豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型,靜脈注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs濃縮條件培養(yǎng)液干預(yù),正常豚鼠和放療但不干預(yù)豚鼠作為對照,在放療結(jié)束后1周,1月,3月,6月分別用炭末法檢測豚鼠鼻黏膜粘液纖毛清除時間(MCT),鼻黏膜切片HE染色觀察病理改變,掃描電鏡觀察黏膜纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)評估治療效果。結(jié)果：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻組在放療結(jié)束后1周,1月時,粘液纖毛清除時間,黏膜水腫程度均優(yōu)于放療對照組。放療后第6月條件培養(yǎng)液滴鼻組纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)優(yōu)于放療對照組。結(jié)論：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻對豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型有治療作用。方法：構(gòu)建豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型,靜脈注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs濃縮條件培養(yǎng)液干預(yù),正常豚鼠和放療但不干預(yù)豚鼠作為對照,在放療結(jié)束后1周,1月,3月,6月分別用炭末法檢測豚鼠鼻黏膜粘液纖毛清除時間(MCT),鼻黏膜切片HE染色觀察病理改變,掃描電鏡觀察黏膜纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)評估治療效果。結(jié)果：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻組在放療結(jié)束后1周,1月時,粘液纖毛清除時間,黏膜水腫程度均優(yōu)于放療對照組。放療后第6月條件培養(yǎng)液滴鼻組纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)優(yōu)于放療對照組。結(jié)論：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻對豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型有治療作用。第三部分hUC-MSCs修復(fù)鼻黏膜放射性損傷的機制研究目的：探討hUC-MSCs修復(fù)鼻黏膜放射性損傷的機制。方法：攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad-GFP)標記hUC-MSCs,經(jīng)靜脈注射到豚鼠模型,注射后第3天,10天,20天,30天取鼻黏膜冰凍切片,采用熒光顯微鏡下直接觀察和免疫熒光染色方法檢測GFP標記細胞遷徙、分化情況。體外培養(yǎng)并鑒定人鼻黏膜上皮細胞,與hUC-MSCs共培養(yǎng),觀察hUC-MSCs的形態(tài)學(xué)變化,能否表達鼻黏膜上皮細胞特異性蛋白,對放療后鼻黏膜上皮細胞的趨化作用,hUC-MSCs條件培養(yǎng)液對鼻黏膜上皮細胞增殖的影響等指標,探討hUC-MSCs修復(fù)鼻黏膜放射性損傷的機制。結(jié)果：Ad-GFP標記hUC-MSCs在注射后3天和10天冰凍切片熒光顯微鏡可直接觀察到標記細胞,注射后20天僅能通過免疫熒光染色檢測到GFP蛋白,主要位于黏膜固有層,不能表達β-Tubulin蛋白。人鼻黏膜上皮細胞與hUC-MSCs直接共培養(yǎng),部分hUC-MSCs形態(tài)發(fā)生變化,可表達上皮細胞特異蛋白角蛋白。hUC-MSCs對放療后鼻黏膜上皮細胞有趨化,hUC-MSCs條件培養(yǎng)液可促進鼻黏膜上皮細胞增殖。結(jié)論：hUC-MSCs可能通過旁分泌機制促進豚鼠放射性損傷鼻黏膜粘液纖毛系統(tǒng)功能恢復(fù)。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R765.25

【參考文獻】

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