本文關(guān)鍵詞： 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù) 分化 綠色熒光蛋白 腺病毒 間充質(zhì)干細(xì)胞 鼻黏膜 放射性損傷 干細(xì)胞移植 條件培養(yǎng)液 旁分泌 分化 遷徙 趨化作用 β-Tubulin 共培養(yǎng)　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及熒光標(biāo)記目的：探討分離,培養(yǎng),鑒定,熒光標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物學(xué)特性,為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。方法：分別用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),每3-4 d按照1：3比例傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),統(tǒng)計(jì)開(kāi)始收獲原代(P0)細(xì)胞的時(shí)間和PO細(xì)胞的產(chǎn)量,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)凍存復(fù)蘇活細(xì)胞比例。通過(guò)觀察細(xì)胞貼壁能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型,體外成脂、成骨、成軟骨定向誘導(dǎo)檢測(cè)分化能力,鑒定其是否符合間充質(zhì)干細(xì)胞國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。用攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染hUC-MSCs標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記效率。結(jié)果：hUC-MSCs呈長(zhǎng)梭形,貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞密集時(shí)呈放射狀或漩渦狀排列。酶消化法細(xì)胞收獲PO細(xì)胞時(shí)間早于組織塊法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但產(chǎn)量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。兩種方法獲得細(xì)胞增殖能力,凍存復(fù)蘇活細(xì)胞比例無(wú)明顯差異。兩種方法獲得細(xì)胞都能在塑料培養(yǎng)容器上貼壁,流式檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在體外誘導(dǎo)環(huán)境下能向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后可見(jiàn)較強(qiáng)綠色熒光,流式檢測(cè)GFP陽(yáng)性率94.4%。結(jié)論：酶消化法和組織塊法均可獲得足量原代hUC-MSCs,通過(guò)細(xì)胞形態(tài),表型,成骨,成脂,成軟骨分化鑒定證明符合國(guó)際干細(xì)胞協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs具有效率高,熒光強(qiáng)的特點(diǎn)。第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及熒光標(biāo)記目的：探討分離,培養(yǎng),鑒定,熒光標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物學(xué)特性,為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。方法：分別用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),每3-4 d按照1：3比例傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),統(tǒng)計(jì)開(kāi)始收獲原代(P0)細(xì)胞的時(shí)間和PO細(xì)胞的產(chǎn)量,CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)凍存復(fù)蘇活細(xì)胞比例。通過(guò)觀察細(xì)胞貼壁能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型,體外成脂、成骨、成軟骨定向誘導(dǎo)檢測(cè)分化能力,鑒定其是否符合間充質(zhì)干細(xì)胞國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。用攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染hUC-MSCs標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記效率。結(jié)果：hUC-MSCs呈長(zhǎng)梭形,貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞密集時(shí)呈放射狀或漩渦狀排列。酶消化法細(xì)胞收獲PO細(xì)胞時(shí)間早于組織塊法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但產(chǎn)量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。兩種方法獲得細(xì)胞增殖能力,凍存復(fù)蘇活細(xì)胞比例無(wú)明顯差異。兩種方法獲得細(xì)胞都能在塑料培養(yǎng)容器上貼壁,流式檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在體外誘導(dǎo)環(huán)境下能向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后可見(jiàn)較強(qiáng)綠色熒光,流式檢測(cè)GFP陽(yáng)性率94.4%。結(jié)論：酶消化法和組織塊法均可獲得足量原代hUC-MSCs,通過(guò)細(xì)胞形態(tài),表型,成骨,成脂,成軟骨分化鑒定證明符合國(guó)際干細(xì)胞協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。Ad-GFP轉(zhuǎn)染hUC-MSCs具有效率高,熒光強(qiáng)的特點(diǎn)。第二部分hUC-MSCs修復(fù)豚鼠鼻黏膜放射性損傷的效果目的：檢測(cè)hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻對(duì)豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型的治療效果。方法：構(gòu)建豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型,靜脈注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs濃縮條件培養(yǎng)液干預(yù),正常豚鼠和放療但不干預(yù)豚鼠作為對(duì)照,在放療結(jié)束后1周,1月,3月,6月分別用炭末法檢測(cè)豚鼠鼻黏膜粘液纖毛清除時(shí)間(MCT),鼻黏膜切片HE染色觀察病理改變,掃描電鏡觀察黏膜纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)評(píng)估治療效果。結(jié)果：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻組在放療結(jié)束后1周,1月時(shí),粘液纖毛清除時(shí)間,黏膜水腫程度均優(yōu)于放療對(duì)照組。放療后第6月條件培養(yǎng)液滴鼻組纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)優(yōu)于放療對(duì)照組。結(jié)論：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻對(duì)豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型有治療作用。方法：構(gòu)建豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型,靜脈注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs濃縮條件培養(yǎng)液干預(yù),正常豚鼠和放療但不干預(yù)豚鼠作為對(duì)照,在放療結(jié)束后1周,1月,3月,6月分別用炭末法檢測(cè)豚鼠鼻黏膜粘液纖毛清除時(shí)間(MCT),鼻黏膜切片HE染色觀察病理改變,掃描電鏡觀察黏膜纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)評(píng)估治療效果。結(jié)果：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻組在放療結(jié)束后1周,1月時(shí),粘液纖毛清除時(shí)間,黏膜水腫程度均優(yōu)于放療對(duì)照組。放療后第6月條件培養(yǎng)液滴鼻組纖毛覆蓋率及纖毛形態(tài)優(yōu)于放療對(duì)照組。結(jié)論：hUC-MSCs靜脈注射和條件培養(yǎng)液滴鼻對(duì)豚鼠鼻黏膜放射性損傷模型有治療作用。第三部分hUC-MSCs修復(fù)鼻黏膜放射性損傷的機(jī)制研究目的：探討hUC-MSCs修復(fù)鼻黏膜放射性損傷的機(jī)制。方法：攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體(Ad-GFP)標(biāo)記hUC-MSCs,經(jīng)靜脈注射到豚鼠模型,注射后第3天,10天,20天,30天取鼻黏膜冰凍切片,采用熒光顯微鏡下直接觀察和免疫熒光染色方法檢測(cè)GFP標(biāo)記細(xì)胞遷徙、分化情況。體外培養(yǎng)并鑒定人鼻黏膜上皮細(xì)胞,與hUC-MSCs共培養(yǎng),觀察hUC-MSCs的形態(tài)學(xué)變化,能否表達(dá)鼻黏膜上皮細(xì)胞特異性蛋白,對(duì)放療后鼻黏膜上皮細(xì)胞的趨化作用,hUC-MSCs條件培養(yǎng)液對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞增殖的影響等指標(biāo),探討hUC-MSCs修復(fù)鼻黏膜放射性損傷的機(jī)制。結(jié)果：Ad-GFP標(biāo)記hUC-MSCs在注射后3天和10天冰凍切片熒光顯微鏡可直接觀察到標(biāo)記細(xì)胞,注射后20天僅能通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)到GFP蛋白,主要位于黏膜固有層,不能表達(dá)β-Tubulin蛋白。人鼻黏膜上皮細(xì)胞與hUC-MSCs直接共培養(yǎng),部分hUC-MSCs形態(tài)發(fā)生變化,可表達(dá)上皮細(xì)胞特異蛋白角蛋白。hUC-MSCs對(duì)放療后鼻黏膜上皮細(xì)胞有趨化,hUC-MSCs條件培養(yǎng)液可促進(jìn)鼻黏膜上皮細(xì)胞增殖。結(jié)論：hUC-MSCs可能通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)豚鼠放射性損傷鼻黏膜粘液纖毛系統(tǒng)功能恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R765.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1515549