本文關(guān)鍵詞： 維生素C 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 年齡相關(guān)性黃斑變性 SIRT1 氧化應(yīng)激反應(yīng)　出處：《武漢大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 氧化應(yīng)激反應(yīng)一直被認(rèn)為是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)最常見的病因。防止視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化損傷將有望成為AMI)的治療方法。在此研究中,目的是研究氧化應(yīng)激狀態(tài)下維生素C作為抗氧化劑對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用以及維生素C和SIRT1之間的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法： 1人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立以及維生素C保護(hù)作用的觀察。外源性過氧化氫(H202)梯度濃度作用于ARPE-19細(xì)胞,觀察細(xì)胞形態(tài)變化,MTT方法檢測細(xì)胞活力,2’7’-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成,確定H202的適合作用濃度(100μmol)。梯度濃度的維生素C作用于氧化應(yīng)激下的ARPE-19細(xì)胞,檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS的改變。 2氧化應(yīng)激狀態(tài)下ARPE-19細(xì)胞在維生素C預(yù)處理后檢測SIRT1、p53和Foxo3基因的表達(dá)。適當(dāng)濃度(100μmol)的H202作用于ARPE-19細(xì)胞12小時或24小時,用梯度濃度(0μmol、20μmol、100μmol、500μmol)的維生素C預(yù)處理后,用定量即時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測SIRT1轉(zhuǎn)錄因子及應(yīng)激反應(yīng)因子p53和Foxo3基因表達(dá)。 3氧化應(yīng)激狀態(tài)下ARPE-19細(xì)胞在維生素C預(yù)處理后,用100mmol的白藜蘆(RSV)和5mmol的煙酰胺(NA)作用于細(xì)胞。使用靶向siRNA對SIRT1進(jìn)行敲除,作為陰性對照。觀察RSV和NA對不同濃度梯度維生素C作用下的ARPE-19細(xì)胞的生存活力、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。 4Western Blot法檢測在敲除或上調(diào)SIRT1表達(dá)后p53和Foxo3基因表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,用l00μmo1濃度的維生素C預(yù)處理ARPE-19細(xì)胞后用Western Blot法檢測在敲除或上調(diào)SIRT1基因表達(dá)后,ARPE-19細(xì)胞p53和Foxo3基因表達(dá)以及蛋白表達(dá)的情況。 結(jié)果： 1外源性H202作用下,ARPE-19細(xì)胞生存力下降且呈劑量依賴性及時間依賴性,同時ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升,提示H202處理后可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。考慮到人體自然狀態(tài)下,RPE所受到的氧化應(yīng)激損傷是低強(qiáng)度、長時間的累積效應(yīng),所以H202的適合作用濃度確定為100μmol。維生素C處理后,中等濃度的維生素C顯著提高了ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激下的生存率,同時顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及細(xì)胞凋亡率。而低濃度和高濃度的維生素C無此作用。 2維生素C影響SIRT1轉(zhuǎn)錄因子和應(yīng)激反應(yīng)因子(p53和Foxo3)的表達(dá)。H202可減少SIRT1的表達(dá)。當(dāng)維生素C濃度達(dá)到100μmol時,不僅可顯著增加SIRT1的表達(dá),而且也顯著提高了p53和Foxo3的基因表達(dá)水平。 3SIRT1參與維生素C的抗氧化保護(hù)作用。SIRT1激動劑RSV不僅可顯著激發(fā)維生素C的保護(hù)作用,還能使更低濃度和更高濃度維生素C具有抗氧化性能。與此同時,SIRT1抑制劑NA可減輕中等濃度維生素C的抗氧化保護(hù)作用。 4氧化應(yīng)激狀態(tài)狀態(tài)下,在敲除或上調(diào)SIRT1表達(dá)后,觀察維生素C對RPE細(xì)胞p53和Foxo3基因及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示p53和Foxo3的調(diào)節(jié)異常依賴于SIRT1的調(diào)節(jié)而不是維生素C。 結(jié)論： 1外源性H202可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞損傷。適當(dāng)濃度的維生素C可降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,減少ARPE-19細(xì)胞損傷及凋亡,起到抗氧化損傷保護(hù)作用。 2維生素C的抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用涉及SIRT1基因的調(diào)控。 3聯(lián)合應(yīng)用維生素C和白藜蘆醇(RSV)可有效抵御視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷,此項研究將為維生素C和白藜蘆醇(RSV)聯(lián)合應(yīng)用治療AMD提供依據(jù)。
[Abstract]:Objective:
Oxidative stress has been considered the age-related macular degeneration (AMD) is the most common cause. To prevent oxidative damage of retinal pigment epithelial cells is expected to become AMI) treatment. In this study, the purpose is to study the oxidative stress state of vitamin C as antioxidant agent between the protective effect on retinal pigment epithelial cells and vitamin C SIRT1 and the regulatory mechanism.
Method錛，

本文編號：1515243