本文關(guān)鍵詞： 先天性靜止性夜盲 L-鈣通道 電生理 全細胞膜片鉗 視覺信號傳導(dǎo) 大鼠　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness,CSNB)是一類先天性、非進展性、以視網(wǎng)膜視桿信號系統(tǒng)功能障礙為主的眼科疾病,其發(fā)病機制尚不完全明確,且缺乏有效治療手段。我們實驗室發(fā)現(xiàn)的一種CSNB模式大鼠為編碼L-鈣通道的Cacna1f基因自然突變所致,主要影響視網(wǎng)膜視桿信號系統(tǒng),電生理及行為學(xué)證明其克服了基因工程誘導(dǎo)模式動物與臨床實際差異較大的缺陷,因此可以作為研究CSNB發(fā)病機制及視網(wǎng)膜信號回路之間關(guān)系的一種新模型。以往研究工作主要集中在視網(wǎng)膜第一級神經(jīng)元水平(視桿細胞),推測其發(fā)病機制為視桿細胞突觸末端膜鈣通道功能障礙,后者對含遞質(zhì)囊泡釋放產(chǎn)生影響,導(dǎo)致視覺信號傳導(dǎo)受限而發(fā)病。該通道在視桿雙極細胞(rod bipolar cells, RBCs)中也有表達,其在CSNB發(fā)病中的作用尚未見文獻報道。 鑒于雙極細胞在視覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo),以及視桿與視錐回路間相互作用中起著非常重要的作用,本實驗采用利用全細胞膜片鉗技術(shù)對本實驗室培育的CSNB大鼠RBCsL-鈣通道電生理學(xué)和通道藥理學(xué)特征進行觀察,并探討其與視網(wǎng)膜視覺信號傳遞障礙之間的聯(lián)系。脊椎動物視網(wǎng)膜有非常相似的解剖結(jié)構(gòu)和生理機能,不同動物的實驗結(jié)果種群變異性很小,因此研究CSNB鈣通道電流特征可為進一步明確這種疾病的發(fā)病機制及采取針對性的視覺干預(yù)保護措施提供依據(jù)。 材料與方法 實驗采用本實驗室鑒定發(fā)現(xiàn),并建立近交系的CSNB大鼠(F20/F21,4～8周齡)及正常同齡對照SD大鼠,深度麻醉后處死大鼠摘取眼球,利用手動切片機制作視網(wǎng)膜切片,在紅外干涉顯微成像系統(tǒng)中尋找RBCs胞體,運用全細胞膜片鉗模式記錄L-鈣通道電流;給細胞施加階躍刺激(從-60 mV除極至0mV,時程200ms),記錄程序刺激后細胞靜息膜電容(restCm)的變化值(△Cm),并據(jù)此計算胞吐系數(shù)EI( Exocytotic index);分別施加L-鈣通道阻斷劑nifedipine和GABA受體阻斷劑PTX來觀察通道的藥理學(xué)特征;用應(yīng)用Axon公司的pClamp8.1軟件進行數(shù)據(jù)測量分析,獲取RBCsL-鈣通道電生理學(xué)指標。在Clampfit上選取有代表性的實驗記錄,導(dǎo)入到Origin軟件進行分析和作圖。 結(jié)果 1. RBCsL-鈣通道電流特征 給細胞施加階躍刺激和斜坡刺激后,在SD組和CSNB組大鼠的RBCs中均可記錄出內(nèi)向電流,其電生理學(xué)特征符合L-鈣通道電流特點:在較高除極電位激活;失活緩慢;載流離子為Ca2+:用同等濃度Mg2+代替灌流液中的Ca2+,未能記錄到類似電流。 2. L-鈣通道藥理學(xué)特性 特異性L-鈣通道阻斷劑nifedipine(10μm)可以完全阻斷SD組和CSNB組所記錄的內(nèi)向電流。結(jié)合其電生理學(xué)特征我們可以判定本實驗在RBCs所記錄到的內(nèi)向電流為L型鈣通道電流。 3. SD大鼠與CSNB大鼠RBCs L-鈣通道電流比較SD組大鼠RBCs L-鈣通道于-40mV左右開放,通道電流于-20和-30mV之間達到峰值:-33.2±2.5pA(n=20)。CSNB組大鼠RBCs L-鈣通道于-20mV和-30mV之間開始激活,通道電流于-15mV左右達峰,峰值為12.2±2.3pA(n=23)。 4. SD大鼠視網(wǎng)膜RBCs的負反饋電流 SD組較強程度除極(-20m和-30mv)時可在Ca2+電流上發(fā)現(xiàn)較小的外向的電流(n=11),電流大小與細胞在切片中的位置有關(guān),位置越深外向電流越大。應(yīng)用GABAA和GABAC受體阻斷劑PTX(100μm)能夠明顯阻斷這種外向電流,提示其為為RBCs的突觸前GABAA和GABAC受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current ,IPSCS)。而在CSNB組所有記錄細胞中均未發(fā)現(xiàn)此種外向電流。 5.SD大鼠與CSNB大鼠RBCs胞吐指數(shù)差異 給細胞施加階躍刺激(從-60 mV除極至0mV,時程200ms),記錄程序刺激后restCm的變化值(△Cm),并據(jù)此計算胞吐系數(shù)EI:SD組大鼠restCm為:4146.600±544.202 fF,△Cm為29.600±7.472 fF,EI:0.723±0.199;CSNB組大鼠restCm為:4356.957±549.493 ,△Cm為12.348±6.919 , EI為0.291±0.173。SD組大鼠△Cm較CSNB組大鼠高,EI較CSNB組大鼠大,有明顯差異(p0.01)與對照組比較,CSNB大鼠的△Cm和EI明顯降低(p0.01)。 結(jié)論 1.實驗在CSNB組和SD組大鼠RBCs中所記錄的電流為L-鈣通電流;CSNB組大鼠RBCs L-鈣通電流峰值明顯小于SD組大鼠,推測CSNB大鼠電流強度降低導(dǎo)致胞內(nèi),尤其是突觸終末的Ca2+濃度降低,難以達到觸發(fā)正常速率神經(jīng)遞質(zhì)釋放所需要的濃度,因此可能會使突觸終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放發(fā)生障礙,從而影響視覺信號向下一級神經(jīng)元傳導(dǎo)。 2. CSNB組大鼠I-V曲線較SD組右移大約20mV,會導(dǎo)致通道在雙極細胞暗適應(yīng)生理電位范圍(-70mV—-20mV)內(nèi)難以除極化。 3. CSNB大鼠RBCs的突觸前GABAA和GABAC受體介導(dǎo)的抑制性突觸后電流(IPSCS)消失,提示其觸終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程發(fā)生障礙,難以觸發(fā)來自AⅡACs的負反饋。這種負反饋障礙會影響rod視覺信號局部突觸環(huán)路放大機制和視覺信號向神經(jīng)節(jié)細胞傳導(dǎo)的可塑性。 4.CSNB大鼠胞吐系數(shù)EI明顯降低,說明CSNB組大鼠RBCs因為鈣內(nèi)流導(dǎo)致遞質(zhì)囊泡和細胞膜融合,使細胞膜表面積(胞吐系數(shù))增加的程度明顯弱于SD組大鼠。因此得到關(guān)于CSNB組RBCs觸終末神經(jīng)遞質(zhì)囊泡釋放發(fā)生障礙更為直觀的證據(jù)。 綜上所述,CSNB大鼠雙極細胞L-鈣通道電生理特征改變會嚴重影響其向下級神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì),其可能是導(dǎo)致CSNB發(fā)病的機制之一。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R774

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：1513398