本文關(guān)鍵詞： 青光眼 內(nèi)皮素-1 小梁細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì) 纖維連接蛋白 Ⅳ膠原 吞噬 肌動(dòng)蛋白 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子　出處：《華中科技大學(xué)》2010年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 青光眼(glaucoma)是一組以視神經(jīng)受損和視功能損害為共同特征的不可逆致盲眼病。病理性眼壓(Introcular Pressure, IOP)升高是青光眼視神經(jīng)受損的最主要危險(xiǎn)因素。研究表明小梁網(wǎng)是房水(Aqueous humor, AH)流出的最關(guān)鍵部位,小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)堆積,吞噬功能受損、小梁網(wǎng)細(xì)胞骨架的重構(gòu)導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞形態(tài)、韌性、強(qiáng)度、細(xì)胞間黏附性改變等,是房水阻力增加、病理性眼壓升高的主要原因。 內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一種小分子生物活性多肽,在調(diào)控血管舒縮、細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要作用。同時(shí),ET-1還是一種強(qiáng)大的促纖維化因子,在腎、肺和心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和纖維化方面扮演重要的角色,另外,ET-1通過(guò)活化Rho激酶導(dǎo)致血管內(nèi)皮和肺上皮細(xì)胞等細(xì)胞骨架的重構(gòu)。ET-1還是重要的促炎和促氧化應(yīng)激因子,可以促進(jìn)細(xì)胞分泌其他因子如ICAM-1,TNF-α,IL-1、IL-6等及過(guò)氧化物等,介導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。 最近,研究表明原發(fā)開(kāi)角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)、正常眼壓青光眼(NormalTension Glaucoma, NTG),色素剝脫綜合癥患者和青光眼動(dòng)物模型房水中的ET-1水平比正常明顯升高,認(rèn)為ET-1與青光眼發(fā)病密切相關(guān)。ET-1作為促纖維化、促氧化應(yīng)激和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子,在小梁網(wǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)合成、吞噬功能、細(xì)胞骨架重構(gòu)方面的作用尚不清楚。本研究擬通過(guò)以下四部分的研究系統(tǒng)觀察ET-1對(duì)小梁細(xì)胞功能的影響：1.ET-1對(duì)體外培養(yǎng)人小梁網(wǎng)細(xì)胞(human trabecular meshwork cells, HTMCs)的細(xì)胞外基質(zhì)----纖維連接蛋白(fibronectin, FN)、Ⅳ型膠原(typeⅣcollagen, ColⅣ)表達(dá)的影響,及ET-1對(duì)灌注培養(yǎng)人眼前段小梁網(wǎng)組織中FN、ColⅣ表達(dá)及眼壓的影響；2.觀察CTGF在ET-1促HTMCs合成FN、ColⅣ中的作用；3.觀察ET-1對(duì)HTMCs吞噬功能的影響；4.觀察ET-1對(duì)HTMCs細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)及重構(gòu)的影響。以期探明ET-1在調(diào)控小梁網(wǎng)房水流出的作用及其分子機(jī)制,為POAG降眼壓治療提供新的理論依據(jù)。 第一部分：ET-1對(duì)小梁網(wǎng)FN和Ⅳ型膠原表達(dá)的作用研究 目的：1.觀察ET-1及ET受體(ETR)拮抗劑對(duì)體外培養(yǎng)人小梁細(xì)胞(HTMCs)中纖維連結(jié)蛋白(FN)和Ⅳ型膠原(ColⅣ)表達(dá)的影響。 2.觀察ET-1對(duì)灌注培養(yǎng)人眼前段小梁網(wǎng)組織中FN、ColⅣ表達(dá)及眼壓的影響。 方法：1.體外培養(yǎng)HTMCs,并用抗神經(jīng)元特異性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、纖維連結(jié)蛋白(fibronectin, FN)、層粘連蛋白(laminin, LN)、Ⅷ因子相關(guān)抗原(FactorⅧrelated antigen, FⅧRag)免疫組織化學(xué)染色鑒定HTMCs。 2.ET-1及ETR拮抗劑對(duì)體外培養(yǎng)HTMCs中FN、ColⅣ表達(dá)的影響：取傳3代HTMCs,①觀察不同濃度ET-1對(duì)HTMCs中FN和ColⅣ表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(0 mol／L ET-1)；ET-1低劑量組(10-9 mol／L)；ET-1中劑量組(10-8mol／L)；ET-1高劑量組(10-7mol／L),各組細(xì)胞分別孵育72h后,Weston-blot檢測(cè)FN、ColⅣ的表達(dá)；②觀察ETR拮抗劑對(duì)HTMCs中FN,ColⅣ表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組；ET-1組干預(yù)組(10-7mol／L ET-1)；ETAR拮抗劑干預(yù)組(10-7mol／L ET-1+10-7mol／L BQ123)：ETBR拮抗劑干預(yù)組(10-7 mol／L ET-1+10-7mol／LBQ788),各組細(xì)胞分別孵育72h后,免疫熒光染色、Weston-blot檢測(cè)FN、ColⅣ的表達(dá)。 3.ET-1對(duì)灌注培養(yǎng)人眼前段小梁網(wǎng)組織FN和ColⅣ表達(dá)及眼壓的影響：①建立人眼前段灌注培養(yǎng)模型；②取人眼(n=3對(duì))灌注培養(yǎng)24h,記錄基線眼壓,然后分為對(duì)照眼(左眼),ET-1干預(yù)眼(右眼)；對(duì)照眼給予DMEM灌注培養(yǎng),ET-1干預(yù)眼給予10-7mol／L ET-1灌注培養(yǎng),記錄干預(yù)后不同時(shí)點(diǎn)(6h,12h,18h,24h,30h,36h,42h,48h,54h,60h,66h,72h)對(duì)照眼和干預(yù)眼眼壓；72h后人眼前段行4%多聚甲醛固定,石蠟切片,免疫熒光檢測(cè)人眼小梁網(wǎng)組織中FN、ColⅣ的表達(dá)。 結(jié)果：1.體外培養(yǎng)HTMCs呈NSE、FN、LN陽(yáng)性表達(dá),FⅧRag陰性表達(dá),體外培養(yǎng)成功。 2.ET-1及ETR拮抗劑對(duì)體外培養(yǎng)HTMCs中FN和ColⅣ表達(dá)的作用：①10-9～10-7mol／LET-1干預(yù)后HTMCs中FN表達(dá)上調(diào),呈劑量依賴(lài)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；10-8～10-7mol／L ET-1干預(yù)后HTMCs中ColⅣ表達(dá)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)； ②給予ETAR拮抗劑BQ123后,與ET-1組相比,HTMCs中FN、ColⅣ的表達(dá)降低(P0.05)；但給予ETBR拮抗劑BQ788后,HTMCs中FN、ColⅣ的表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05)。 3.ET-1對(duì)灌注培養(yǎng)人眼前段小梁網(wǎng)組織中FN和ColⅣ表達(dá)及眼壓的影響： ①10-7mol／L ET-1干預(yù)灌注培養(yǎng)的人眼前段后,小梁網(wǎng)組織中FN和ColⅣ表達(dá)和分布明顯增多。 ②正常人眼前段基線眼壓波動(dòng)在15～20mmHg左右,對(duì)照眼基線眼壓分別為：15,18,20mmHg,ET-1干預(yù)眼基線眼壓分別為16,19,19mmHg,給予ET-1干預(yù)后眼壓升高,72h后眼壓分別為24,26,27mmHg,明顯高于對(duì)照眼眼壓16,19,20mmHg。 結(jié)論：1.ET-1能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)HTMCs中FN、ColⅣ的表達(dá),其作用是通過(guò)激動(dòng)ETAR起作用的。 2.ET-1能夠促進(jìn)體內(nèi)灌注培養(yǎng)人眼前段小梁組織中FN、ColⅣ的表達(dá),并導(dǎo)致灌注培養(yǎng)模型眼眼壓增高。 第二部分：CTGF在ET-1促小梁細(xì)胞FN和Ⅵ膠原表達(dá)中的作用研究 目的：觀察結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)在ET-1促HTMCs合成FN和ColⅣ中的作用 方法：取傳三代HTMCs①觀察不同時(shí)間點(diǎn)ET-1對(duì)小梁細(xì)胞CTGF、FN和ColⅣmRNA的影響。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對(duì)照組、24h干預(yù)組,48h干預(yù)組,72h干預(yù)組,給予10-7molET-1干預(yù)HTMCs,于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,用RT-PCR觀察CTGF、FN和ColⅣmRNA的變化。②設(shè)計(jì)并合成4條CTGF反義寡核苷酸(CTGF-ASDON)序列,轉(zhuǎn)染傳三代培養(yǎng)人HTMCs,RT-PCR檢測(cè)其干擾效率,選擇效果最有效的CTGF-ASDON序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。③觀察CTGF-ASDON在ET-1促HTMCs中FN和ColⅣ表達(dá)的影響：選擇傳三代培養(yǎng)HTMCs,隨機(jī)分為5組,A：正常對(duì)照組(單純DMEM)、B：ET-1干預(yù)組(DMEM+10-7mol ET-1)、C：?jiǎn)渭僀TGF-ASDON組(DMEM+脂質(zhì)體+100nmol／LCTGF-ASDON)、D組：脂質(zhì)體對(duì)照組(DMEM+脂質(zhì)體)、E組：CTGF-ASDON+ET-1組(DMEM+10-7molET-1+脂質(zhì)體+100nmol／LCTGF-ASDON),轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,Western-blot檢測(cè)CTGF、FN和ColⅣ的表達(dá)。 結(jié)果：①給予ET1后,HTMCs中CTGF、FN和ColⅣmRNA水平較對(duì)照組明顯上調(diào)(P0.01),CTGFmRNA水平在48h達(dá)到高峰,FN和ColⅣmRNA在72h達(dá)到高峰,(P0.01)。 ②合成CTGF-ASDON序列轉(zhuǎn)染HTMCs后,CTGF-ASDON1干擾效率最佳,能下調(diào)CTGFmRNA水平達(dá)40%。 ③CTGF-ASDON+ET-1組與ET-1組相比,HTMCs中FN和ColⅣ表達(dá)明顯降低(P0.05) 結(jié)論：下調(diào)CTGF后可減少ET-1促進(jìn)HTMCs中FN、ColⅣ的表達(dá),CTGF是ET-1促HTMCs合成FN和ColⅣ的重要的下游信號(hào)分子。 第三部分ET-1對(duì)體外培養(yǎng)人小梁細(xì)胞吞噬功能的作用研究 目的：觀察ET-1及ETR拮抗劑對(duì)體外培養(yǎng)HTMCs吞噬功能的影響。 方法：取傳3代培養(yǎng)的HTMCs,①觀察HTMCs吞噬動(dòng)力學(xué)：HTMCs與直徑0.5μm熒光標(biāo)記的乳膠微粒共孵育0、4、8、12、24、48、72h,熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)定量觀察吞噬乳膠顆粒數(shù)。②觀察不同濃度ET-1對(duì)HTMCs吞噬功能的影響：實(shí)驗(yàn)分為四組,對(duì)照組；ET-1低劑量組(10-9mol／L)；ET-1中劑量組(10-8 mol／L)；ET-1高劑量組(10-7mol／L),·與0.5μm乳膠顆粒共孵育24h后觀察各組HTMCs吞噬乳膠顆粒數(shù)。③觀察ETR拮抗劑對(duì)吞噬功能的影響：實(shí)驗(yàn)分為4組,對(duì)照組；ET-1組；ETAR拮抗劑組(ET-1+10-7mol／L BQ123)；ETBR拮抗劑組(ET-1+10-7mol／L BQ788),其中ET-1的濃度為10-8 mol／L,并與0.5μm乳膠顆粒共孵育24h,觀察各組HTMCs吞噬乳膠顆粒數(shù)。 結(jié)果：①HTMCs吞噬動(dòng)力學(xué)示：HTMCs與乳膠顆粒共孵育4h時(shí)細(xì)胞后可見(jiàn)明顯的吞噬顆粒,隨時(shí)間延長(zhǎng)吞噬微粒數(shù)明顯增多,24h吞噬微粒密度最佳,48h吞噬微粒達(dá)到飽和,細(xì)胞形態(tài)改變；24h是實(shí)驗(yàn)觀察的最佳時(shí)點(diǎn)。 ②加入10-9～10-7mol／LET-1干預(yù)后,HTMCs吞噬乳膠微球數(shù)明顯減少,呈濃度依賴(lài)性(P0.05)； ③給予ETR拮抗劑干預(yù)后：ETAR拮抗劑組吞噬顆粒較ET-1組明顯增多(P0.05),而ETBR拮抗劑組與ET-1組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：ET-1能抑制體外培養(yǎng)的HTMCs吞噬能力；ET-1主要通過(guò)ETAR來(lái)發(fā)揮其抑制吞噬作用。 第四部分ET-1對(duì)體外培養(yǎng)人小梁細(xì)胞骨架蛋白F-actin的作用研究 目的：觀察ET-1對(duì)HTMCs細(xì)胞骨架蛋白F-actin表達(dá)的影響。 方法：取培養(yǎng)3代HTMCs,隨機(jī)分為四組：對(duì)照組(0 mol／L ET-1)；ET-1低劑量組(10-9mol／L)；ET-1中劑量組(10-8mol／L)；ET-1高劑量組(10-7mol／L),ET-1處理72h后,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)HTMCs中骨架蛋白F-actin的表達(dá),并用FITC-phalloidin熒光探針觀察F-actin在HTMCs內(nèi)的分布。 結(jié)果：①ET-1作用后HTMCs中F-actin表達(dá)明顯增高,在10-9～10-7mol／L濃度范圍內(nèi)呈劑量依耐性(P0.05)；②熒光探針示ET-1組HTMCs中F-actin應(yīng)力纖維和周邊肌動(dòng)蛋白明顯增多、濃集,分布紊亂,細(xì)胞邊緣僵硬銳利；細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間黏結(jié)明顯增多。 結(jié)論：ET-1促進(jìn)HTMCs中F-actin的表達(dá)增多、細(xì)胞黏結(jié)形成,導(dǎo)致細(xì)胞骨架重構(gòu)。 研究總結(jié) 一、主要研究結(jié)果 1.本研究證實(shí)：ET-1能夠通過(guò)ETA受體促進(jìn)體外培養(yǎng)HTMCs中FN及ColⅣ的表達(dá)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ET-1能夠促進(jìn)灌注培養(yǎng)人眼前段小梁組織中FN及ColⅣ的表達(dá),并導(dǎo)致灌注培養(yǎng)人眼前段的眼壓升高。推測(cè)ET-1可能在POAG患者小梁細(xì)胞外基質(zhì)堆積和房水流出阻力中發(fā)揮重要作用。 2.下調(diào)CTGF能明顯抑制ET-1促HTMCs中FN、ColⅣ的表達(dá),提示CTGF可能是ET-1介導(dǎo)FN、ColⅣ表達(dá)的重要下游信號(hào)分子。 3. ET-1能夠通過(guò)ETA受體抑制體外培養(yǎng)HTMCs的吞噬功能。 4.本研究證實(shí)ET-1促進(jìn)體外培養(yǎng)HTMCs細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞骨架重構(gòu)； 二、研究結(jié)論 ET-1可能通過(guò)促進(jìn)HTMCs細(xì)胞外基質(zhì)(如FN、ColⅣ)表達(dá)、細(xì)胞骨架重構(gòu)(如F-actin)和抑制吞噬功能等多方面影響小梁細(xì)胞功能,導(dǎo)致房水流出受阻,眼壓升高。通過(guò)給予ETA受體抑制劑或下調(diào)CTGF的表達(dá),可能有望改善小梁細(xì)胞整體功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R775

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1484577