本文關(guān)鍵詞： CERKL 視網(wǎng)膜變性 TRX2 活性氧物質(zhì) 感光細(xì)胞 凋亡 斑馬魚　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：CERKL是2004年被克隆的一個新基因,因與神經(jīng)酰胺激酶CERK高度同源而被命名為神經(jīng)酰胺類似蛋白(ceramide kinase-like protein, CERKL),該基因的突變會導(dǎo)致嚴(yán)重的視網(wǎng)膜退行性疾病,包括視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)和視錐視桿細(xì)胞營養(yǎng)不良(cone rod dystrophy, CRD),但CERKL在視網(wǎng)膜中的分子功能一直未取得重要進(jìn)展,該基因突變引起視網(wǎng)膜變性的病理機制還不清楚。 為闡釋該基因的致病分子機制,本論文通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等實驗手段,發(fā)現(xiàn)并確定了CERKL與線粒體硫氧還原蛋白TRX2存在相互作用。進(jìn)一步分析這種相互作用的生理意義,發(fā)現(xiàn)CERKL能夠調(diào)控TRX2的氧化還原狀態(tài)。細(xì)胞中過表達(dá)CERKL可維持氧化壓力下TRX2的還原態(tài),從而保護(hù)細(xì)胞免受由氧化壓力引起的細(xì)胞凋亡；用siRNA抑制CERKL表達(dá),在氧脅迫條件下TRX2的還原態(tài)比例顯著降低,細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)積累明顯,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CERKL的兩個致病錯義突變p.R106S和p.C125W,顯著破壞其與TRX2的相互作用,并失去氧化條件下保護(hù)細(xì)胞抗氧化的能力。用siRNA抑制細(xì)胞中TRX2的表達(dá)、或通過添加TRX2還原酶(TrxR2)抑制劑(auranofin)抑制TRX2還原態(tài)的轉(zhuǎn)化,均使得CERKL保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的能力大幅減弱或消失,提示TRX2在CERKL保護(hù)細(xì)胞抗氧化的過程中是必須的。 進(jìn)一步應(yīng)用斑馬魚進(jìn)行體內(nèi)實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中CERKL主要表達(dá)于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的視錐細(xì)胞中。Morpholino抑制斑馬魚CERKL的表達(dá),斑馬魚中出現(xiàn)明顯的類似于視網(wǎng)膜變性癥狀,視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層明顯變短,感光細(xì)胞排列紊亂。TUNEL結(jié)果顯示,視網(wǎng)膜的多個細(xì)胞層中均產(chǎn)生明顯的細(xì)胞凋亡信號。在CERKL敲低的斑馬魚視網(wǎng)膜中,核酸、蛋白、脂類這些生物大分子都發(fā)生了明顯的氧化損傷信號,感光細(xì)胞層的氧化損傷尤為明顯。Redox Westernblot檢測,發(fā)現(xiàn)CERKL缺陷魚中氧化態(tài)的TRX2含量顯著增加。以上斑馬魚in vivo的研究結(jié)果與我們在細(xì)胞實驗中得到的結(jié)果相互驗證,提示CERKL通過調(diào)控TRX2,保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞抵抗氧脅迫引起的細(xì)胞凋亡。 本文首次從分子水平上闡述了CERKL突變引起視網(wǎng)膜變性的分子機制,尤為重要的是,論文揭示了一條機體內(nèi)新的抗ROS引起的細(xì)胞凋亡途徑。發(fā)現(xiàn)CERKL是一個新的調(diào)控因子,在細(xì)胞中它通過調(diào)控TRX2相關(guān)的抗ROS通路,保護(hù)細(xì)胞中的氧化還原平衡,從而起到在氧脅迫情況下的抗凋亡作用。由于代謝過程中ROS積累是視網(wǎng)膜變性以及其它神經(jīng)退行性疾病的共同機制,本文的發(fā)現(xiàn)有可能揭示視網(wǎng)膜變性、黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病以及其它重要的神經(jīng)退行性疾病新的發(fā)病機制,并為這些重要的人類疾病的預(yù)防和治療提供了新的靶點。
[Abstract]:CERKL is a new gene cloned in 2004. Because of its high homology with ceramide kinase CERK, it is named ceramide kinase-like protein (CERKL). Mutations in the gene can lead to severe retinal degenerative diseases, including retina pigmentosa initis pigmentosa. CERKL and cone rod dystrophysis, but the molecular function of CERKL in the retina has not made any significant progress. The pathological mechanism of retinal degeneration caused by this gene mutation is unclear. In order to elucidate the molecular mechanism of the gene, this paper uses yeast two-hybrid, immuno-coprecipitation and other experimental means. The interaction between CERKL and mitochondrial thioxy reducing protein (TRX2) was found and confirmed. The physiological significance of this interaction was further analyzed. It was found that CERKL could regulate the redox state of TRX2. Overexpression of CERKL in cells could maintain the reduced state of TRX2 under oxidative pressure. Thus protecting cells from apoptosis caused by oxidative pressure; When CERKL expression was inhibited by siRNA, the reduction rate of TRX2 decreased significantly under oxygen stress, and reactive oxygen species was induced by reactive oxygen species in cells. Ros) accumulation, which resulted in two missense mutations, P. R106S and p.C125W, of apoptosis. CERKL significantly destroyed the interaction between R106S and TRX2. SiRNA was used to inhibit the expression of TRX2 in the cells. Or by adding TRX2 reductase TrxR2) inhibitor to inhibit the transformation of TRX2 reductive state. The ability of CERKL to protect cells from antioxidant damage was significantly weakened or disappeared, suggesting that TRX2 is necessary in the process of CERKL protection. Zebrafish were further used for in vivo experiments. The results showed that CERKL was mainly expressed in cones of retinal photoreceptor cells in zebrafish. Morpholino inhibited the expression of CERKL in zebrafish. Zebrafish showed obvious symptoms similar to retinal degeneration, retinal photoreceptor cell layer became shorter, photoreceptor cells were disordered. Tunel results showed. In many layers of the retina, there are obvious cell apoptosis signals. In the retina of zebrafish with CERKL knockout, the biological macromolecules such as nucleic acid, protein and lipid have obvious oxidative damage signal. The oxidative damage of photoreceptor cell layer was especially obvious. Redox Westernblot was detected. It was found that the content of oxidized TRX2 in CERKL deficient fish increased significantly. The above results of zebrafish in vivo were verified by our results in cell experiments. The results suggest that CERKL protects retinal cells from apoptosis induced by oxygen stress by regulating TRX 2. In this paper, the molecular mechanism of retinal degeneration caused by CERKL mutation is discussed for the first time at the molecular level. A novel anti-apoptotic pathway induced by ROS was revealed in this paper. It was found that CERKL is a new regulatory factor in cells by regulating the TRX2 related anti-#en3# pathway. Protect the redox balance in the cells, thus play the role of anti-apoptosis under oxygen stress. The accumulation of ROS during metabolism is the common mechanism of retinal degeneration and other neurodegenerative diseases. The findings of this paper may reveal new pathogenesis of retinal diseases such as retinal degeneration, macular degeneration and other important neurodegenerative diseases. It also provides new targets for the prevention and treatment of these important human diseases.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1;Q75

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本文編號：1454846