本文關(guān)鍵詞： 感音神經(jīng)性聾 生物治療 納米載體 乳酸聚乙醇酸-聚乙二醇 內(nèi)耳遞送　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多種原因如強(qiáng)噪聲暴露或者耳毒性藥物應(yīng)用等都能夠引起耳蝸內(nèi)組織結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞的受損。一般情況下，這種損害過程都開始于耳蝸毛細(xì)胞（包括外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞），隨后引起Corti’s器結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致聽覺損傷。耳聾相關(guān)研究認(rèn)為，聽覺損傷最終得以治療，最根本的方法還是通過外源生物干預(yù)治療使耳蝸毛細(xì)胞再生，或者在耳蝸毛細(xì)胞損傷的特定病理時(shí)期進(jìn)行相關(guān)干預(yù)，最終使之得到修復(fù)。 在各種研究開發(fā)的耳聾治療方案中，生物治療是最具有應(yīng)用潛力的。同時(shí)，內(nèi)耳結(jié)構(gòu)內(nèi)部流動(dòng)的液體以及相對(duì)狹小獨(dú)立的空間等特點(diǎn)又使得耳蝸可以作為理想的生物治療體系加以研究應(yīng)用�？茖W(xué)家們經(jīng)過對(duì)不同類型耳聾發(fā)病機(jī)制和聽覺神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的研究和探索，先后發(fā)現(xiàn)了一系列針對(duì)聽功能起保護(hù)或修復(fù)作用的核酸、多肽和小分子化合物等，這些生物分子可以通過對(duì)內(nèi)耳感覺細(xì)胞的修復(fù)或再生，實(shí)現(xiàn)聽功能不同程度的保護(hù)或恢復(fù)。 選擇合適的遞送載體將目的高效、安全地導(dǎo)入內(nèi)耳組織和細(xì)胞中，是耳聾生物治療的關(guān)鍵。常用的載體分為兩大類：病毒載體及非病毒載體。上世紀(jì)九十年代，研究人員首次使用病毒載體將外源基因?qū)雰?nèi)耳，開創(chuàng)了內(nèi)耳細(xì)胞保護(hù)或再生研究中載體技術(shù)開發(fā)應(yīng)用的先河。然而，，病毒性載體的缺陷，以及以往報(bào)道的致死性個(gè)案病例，又讓人們開始重新審視應(yīng)用病毒性載體的安全問題。近年來，對(duì)于載體的選擇及應(yīng)用研究，逐漸轉(zhuǎn)向了非病毒性載體，其中，納米載體應(yīng)用又成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展熱點(diǎn)。研究證實(shí)，納米載體能夠在生物治療過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)特性，具備較高的安全性及細(xì)胞特異性等優(yōu)點(diǎn)，為傳統(tǒng)的耳病防治和干預(yù)研究提供了全新的策略。 聚乳酸-羥基乙酸(poly(D,L-lactide-co-gly-colide)，PLGA)是最具代表性的一類納米類載體系統(tǒng)，為丙交酯和乙交酯的共聚物，具有良好的生物相容性 及生物可降解性。經(jīng)PEG修飾的PLGA納米載體復(fù)合物結(jié)構(gòu)可控，在生理pH值條件下，通過PLGA疏水性核心包載多種多肽、蛋白質(zhì)類藥物，并且依靠該復(fù)合物表面的PEG與帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合并相互作用，保證了多肽、蛋白質(zhì)類藥物在無明顯降解的情況下，通過包吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮治療疾病的作用。 本實(shí)驗(yàn)第一部分通過對(duì)PLGA的表面修飾，成功獲得具有緩釋功能的PLGA-PEG納米顆粒遞送載體，并且通過雙乳法包載BSA蛋白，成功制備mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs，且包載率達(dá)到51.2%。第二部分應(yīng)用已經(jīng)合成mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細(xì)胞系，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)FITC熒光情況，評(píng)估m(xù)PEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外進(jìn)入細(xì)胞的效率，同時(shí)用MTT法檢測(cè)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米遞送系統(tǒng)對(duì)于Hela細(xì)胞的毒性并計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)，我們首次通過手術(shù)手段，應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑導(dǎo)入活體豚鼠內(nèi)耳中，用共聚焦顯微鏡觀察并評(píng)估m(xù)PEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在內(nèi)耳的有效率，驗(yàn)證并突出強(qiáng)調(diào)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs作為一種新型納米載體在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的應(yīng)用潛力。在實(shí)驗(yàn)的第三部分，我們開創(chuàng)性的應(yīng)用脈沖式火花噪聲儀對(duì)正常小型豬進(jìn)行噪聲暴露，通過對(duì)強(qiáng)噪聲暴露后的小型豬模型進(jìn)行聽功能評(píng)估及耳蝸病理形態(tài)學(xué)研究，首次成功建立了基于大型哺乳動(dòng)物的噪聲性聾小型豬動(dòng)物模型，為此后內(nèi)耳導(dǎo)入研究奠定基礎(chǔ)。最后，我們嘗試應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs進(jìn)行噪聲性聾小型豬動(dòng)物模型內(nèi)耳導(dǎo)入研究，以期為mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米載體的內(nèi)耳應(yīng)用提供重要的臨床前研究數(shù)據(jù)。 本研究創(chuàng)新點(diǎn)： 1．用PEG修飾PLGA納米顆粒，并成功通過雙乳法包載BSA蛋白，最終獲的大小約為232±2.6nm、具有良好分散性和緩釋特性的納米顆粒蛋白遞送體系； 2.成功將mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外導(dǎo)入細(xì)胞系，并獲得較高安全性和有效性。同時(shí)，首次實(shí)現(xiàn)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在體豚鼠內(nèi)耳遞送，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性。 3.首次成功建立小型豬噪聲性聾動(dòng)物模型，分析噪聲性聾小型豬聽功能及內(nèi)耳形態(tài)特點(diǎn)，填補(bǔ)了大型哺乳動(dòng)物噪聲性聾動(dòng)物模型的空白。 4.首次嘗試應(yīng)用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米顆粒進(jìn)行小型豬噪聲性聾動(dòng)物模型的內(nèi)耳導(dǎo)入研究，為未來大型哺乳動(dòng)物聽功能干預(yù)研究提供了重要的研究基礎(chǔ)。
[Abstract]:Various causes , such as strong noise exposure or ototoxic drug use , can cause damage to tissue structures or cells in the cochlea . In general , such damage processes begin with cochlear hair cells ( including outer hair cells and inner hair cells ) , which subsequently cause damage to the Corti ' s device structure and eventually lead to hearing impairment . In the treatment of deafness in various research and development , biotherapy is the most promising . At the same time , the fluid inside the inner ear structure and the relatively narrow and independent space can be used as the ideal biological treatment system . The scientists have discovered a series of nucleic acids , polypeptides and small molecule compounds which have been used to protect or repair different types of deafness , and these biomolecules can protect or restore the hearing function to different degrees by repairing or regenerating the sensory cells of the inner ear . In recent years , researchers have gradually shifted to non - viral vectors by introducing foreign genes into the inner ear using viral vectors . Poly ( D , L - lactide - co - gly - colide ) , poly ( D , L - lactide - co - gly - colide ) ( PLGA ) , is the most representative type of nano - carrier system , which is a copolymer of lactide and glycolide and has good biocompatibility . and the PEG - modified PLGA nano - carrier composite structure is controllable , and under the condition of physiological pH value , a plurality of polypeptides and a protein drug are loaded through a PLGA hydrophobic core , and the PEG on the surface of the compound is combined with the cell membrane with a negative charge and interacts so as to ensure the polypeptide and the protein drug to enter the cell through the endocytosis , so as to play the role of treating diseases . In the first part of the experiment , PLGA - PEG nano - particle delivery vehicle with sustained - release function was successfully obtained by surface modification of PLGA , and the cell survival rate was 51.2 % . Innovation point of this study : 1 . The PLGA nanoparticles were modified with PEG and the BSA protein was successfully prepared by double emulsion method . The final product was 232 鹵 2.6 nm , which had good dispersibility and sustained release properties . 2 . The mPEG - PLGA - BSA - FITC - TiO2 was successfully introduced into the cell line in vitro , and high safety and efficacy were obtained . At the same time , the mPEG - PLGA - BSA - FITC - induced drug was first delivered in the inner ear of the guinea pig and showed a significant time - dependence . 3 . The animal model of small pig noise was successfully established for the first time , and the characteristics of hearing function and inner ear morphology were analyzed in order to fill the blank of animal model of noise - induced deafness in large mammals . 4 . In order to provide an important research foundation for the study of auditory function intervention in large mammals in the future , the introduction of mPEG - PLGA - BSA - FITC - TiO2 nanoparticles was first attempted .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.43

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1451303