本文關(guān)鍵詞：Plk1在鼻咽癌和喉癌中的靶向治療價值研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：Plk1(Polo-like kinase 1)是一個從酵母到人類高度保守的真核生物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。大量研究已經(jīng)證明,其主要參與細胞有絲分裂過程的調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并被公認是一個有良好應用前景的惡性腫瘤治療新靶點。然而,關(guān)于Plk1與在鼻咽癌和喉癌中的作用及其靶位治療價值,國內(nèi)外仍鮮有報道。本論文主要采用RNA干擾技術(shù)首次對此進行相對系統(tǒng)的研究,結(jié)果分述匯總?cè)缦? (1)高效Plk1 siRNA序列的快速篩選:首先設(shè)計并合成了四組新的候選Plk1 siRNA序列,然后主要采用人喉癌Hep2細胞系和常用腫瘤細胞系HeLa,結(jié)合細胞表型檢測和基因表達水平分析,對這些候選siRNA序列進行了篩選。細胞生長分裂表型觀察結(jié)果表明,這四組Plk1 siRNA均能夠有效抑制Hep2和HeLa細胞的生長分裂。流式細胞儀分析結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染后72 h,與對照組相比,各Plk1 siRNA轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)明顯的有絲分裂期阻滯效應,大量細胞被阻滯于M期。同時,與對照組相比,在各Plk1 siRNA轉(zhuǎn)染組中,位于sub-G1期的細胞比例顯著升高,強烈提示Plk1 siRNA誘發(fā)細胞發(fā)生凋亡。RT-PCR分析結(jié)果表明,各組Plk1 siRNA均能有效抑制Plk1在mRNA水平上的表達。Western印跡分析結(jié)果表明,各組Plk1 siRNA均能有效抑制Plk1在蛋白質(zhì)水平上的表達。綜合上述結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn):Plk1-siRNA-607、Plk1-siRNA-838和Plk1-siRNA-484這三組序列的效果更強,不僅能顯著抑制內(nèi)源性Plk1的表達,而且也具有很強抑制腫瘤細胞生長、誘發(fā)大規(guī)模細胞凋亡的作用,可用于后續(xù)的以Plk1為靶點的抗腫瘤基因治療藥物研發(fā)。另外,我們也嘗試了逆向篩選思路,即首先直接檢測不同Plk1 siRNA候選序列對細胞生長表型的影響,最后再確證Plk1 siRNA對細胞內(nèi)源性Plk1表達的抑制效應。結(jié)果表明,這種篩選策略和傳統(tǒng)的篩選策略相比,具有簡易、快速和高效的特點,也非常適用于對Plk1 siRNA和小分子抑制劑的大規(guī)模篩選。 (2)Plk1 siRNA-607對鼻咽癌和喉癌細胞生長增殖的影響:本部分研究則在前一部分研究的基礎(chǔ)上,使用篩選出的高效Plk1-siRNA-607序列,在轉(zhuǎn)染后分別設(shè)置了24h和48h兩個檢測時間點,相對系統(tǒng)地研究其對人喉癌細胞系Hep2和人鼻咽癌細胞系HNE1生長、細胞周期和凋亡的影響,由此初步評價以Plk1為靶點開展頭頸癌治療的可行性和潛在應用價值。細胞生長分析結(jié)果表明:Plk1 siRNA-607能夠通過有效的抑制Plk1表達而抑制人喉癌細胞系Hep2和人鼻咽癌細胞系HNE1的生長增殖和誘發(fā)細胞凋亡,且以在Hep2的生長增殖抑制效應要明顯強于HNE1。流式細胞儀分析結(jié)果表明, Plk1 siRNA-607轉(zhuǎn)染組的Hep2和HNE1細胞均出現(xiàn)明顯的有絲分裂期阻滯效應,大量細胞被阻滯于有絲分裂期,磷酸化Histone H3表達水平均顯著提高;且位于sub-G1期的細胞比例顯著升高。Annexin V-FITC細胞凋亡分析結(jié)果表明,Plk1 siRNA-607轉(zhuǎn)染組的Hep2和HNE1細胞均出現(xiàn)大量FITC+/PI 凋亡細胞,表明Plk1 siRNA-607可誘發(fā)Hep2和HNE1細胞發(fā)生細胞凋亡。這些研究結(jié)果表明,siRNA介導的Plk1表達沉默是一種有效的鼻咽癌和喉癌治療策略,提示Plk1可做為一個新的分子靶點用于鼻咽癌和喉癌的治療。 (3)siRNA介導的Plk1表達沉默對COS7細胞生長增殖的影響:在本部分研究中,我們觀察了siRNA介導的Plk1表達沉默對體外轉(zhuǎn)化細胞系COS-7細胞生長增殖的影響,主要目的在于探討Plk1作為分子靶點用于腫瘤治療的普遍性。結(jié)果表明,Plk1表達被抑制后,細胞生長顯著受到抑制,大致大規(guī)模的細胞凋亡,大量細胞進入sub-G1期。該結(jié)果和前述第一部分和第二部分中使用HeLa、Hep2和HNE1等腫瘤細胞系獲得的研究結(jié)果類似,說明Plk1可作為分子靶點用于多種腫瘤的治療。 綜上,本論文對于Plk1在鼻咽癌和喉癌中的作用及其靶向治療價值進行了相對系統(tǒng)的初步研究,為進一步研究和開發(fā)以Plk1為靶點的抗腫瘤治療藥物尤其是鼻咽癌和喉癌的抗腫瘤治療藥物奠定了堅實的基礎(chǔ),具有積極的理論和現(xiàn)實意義。
[Abstract]:Plk1 ( Polo - like kinase 1 ) is a member of a eukaryotic serine / threonine protein kinase family that is highly conserved from yeast to human . A large number of studies have shown that it is mainly involved in the regulation of mitosis and the development of tumor , and is recognized as a promising new target for malignant tumors . However , there are few reports on the role of Plk1 in nasopharyngeal carcinoma and laryngeal carcinoma and its target therapeutic value . The results showed that Plk1 siRNA - 607 , Plk1 - siRNA - 838 and Plk1 - siRNA - 484 could effectively inhibit the expression of Plk1 on protein level . and is also very suitable for large - scale screening of Plk1 siRNA and small molecule inhibitor .

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本文編號：1434551