本文關(guān)鍵詞：敲低STGC3基因表達(dá)對(duì)NP69細(xì)胞生物學(xué)行為的影響　出處：《南華大學(xué)》2013年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：運(yùn)用shRNA技術(shù)，敲低鼻咽癌候選基因STGC3在永生化人鼻咽上皮細(xì)胞系NP69的表達(dá)，分析STGC3基因表達(dá)降低，對(duì)NP69細(xì)胞系生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移及裸鼠成瘤能力的影響，為揭示STGC3基因在鼻咽癌發(fā)病中的作用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：設(shè)計(jì)與構(gòu)建STGC3基因的特異性shRNA真核表達(dá)載體pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3，轉(zhuǎn)染永生化人鼻咽上皮細(xì)胞系NP69， G418篩選，建立pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞系，采用熒光顯微鏡，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP表達(dá)，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果；RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中STGC3基因mRNA的表達(dá)水平；通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)及FCM技術(shù)，分析STGC3基因表達(dá)降低，對(duì)NP69細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及周期分布的影響；施用Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲與遷移能力；運(yùn)用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞的成瘤能力。 結(jié)果：構(gòu)建真核表達(dá)載體pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3，經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定、blast比對(duì)及RT-PCR鑒定，確定pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3真核表達(dá)載體成功構(gòu)建。將pRNAT-U6.1/scramble和pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞系，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，以可見(jiàn)綠色熒光，確定pRNAT-U6.1/scramble、pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3導(dǎo)入NP69細(xì)胞；RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染結(jié)果；結(jié)果表明pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3導(dǎo)入NP69細(xì)胞，可顯著降低STGC3基因在NP69細(xì)胞系中的表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制、FCM分析，轉(zhuǎn)pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度加快；細(xì)胞群體中G2期和S期的細(xì)胞數(shù)目增加，與對(duì)照組比較差異具有顯著性意義(p0.05)。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞的克隆形成能力增強(qiáng)，所形成的細(xì)胞集落數(shù)目多，體積大（p0.01）。Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞相比，pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)（p0.001）。將pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69、pRNAT-U6.1/scramble/NP69及NP69三組細(xì)胞，分別接種于裸鼠皮下，經(jīng)8周飼養(yǎng)，均未見(jiàn)腫瘤的形成。 結(jié)論 1.真核表達(dá)載體pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3，能有效降低STGC3基因在NP69細(xì)胞中的表達(dá)。 2.下調(diào)STGC3基因在NP69細(xì)胞中的表達(dá)，其生長(zhǎng)增殖速度加快，，呈現(xiàn)部分惡性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，但不足以在裸鼠體內(nèi)成瘤。
[Abstract]:Objective: to lower the expression of STGC3 candidate gene in immortalized human nasopharyngeal epithelial cell line NP69 by shRNA technique and analyze the decrease of STGC3 gene expression. The effects on the growth, proliferation, invasion, migration and tumorigenesis of NP69 cell line provide a powerful experimental basis for revealing the role of STGC3 gene in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. Methods: the specific shRNA eukaryotic expression vector pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3 of STGC3 gene was designed and constructed. PRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69 cell line was established by transfection of immortalized human nasopharyngeal epithelial cell line NP69 and G418. The effect of transfection was evaluated by observing the expression of GFP in transfected cells. RT-PCR technique was used to detect the expression of STGC3 gene mRNA in transfected cells. By drawing the cell growth curve, colony formation test and FCM technique, the effect of STGC3 gene expression on the growth, proliferation and cycle distribution of NP69 cells was analyzed. The invasion and migration ability of transfected cells was observed by Transwell invasion and migration assay. The tumorigenesis ability of pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69 cells was observed by nude mice tumorigenesis test. Results: the eukaryotic expression vector pRNAT-U6.1 / shRNA-STGC3 was constructed, which was digested by double enzyme, sequenced and compared with RT-PCR. To determine the successful construction of pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3 eukaryotic expression vector. PRNAT-U6.1/scramble and pRNAT-U6.1/shR. NA/STGC3 recombinant plasmid was transfected into NP69 cell line. The expression of GFP was observed by fluorescence microscope, and pRNAT-U6.1/scramble was determined by visible green fluorescence. PRNAT-U6.1/shRNA/STGC3 was introduced into NP69 cells. The transfection results were verified by RT-PCR. The results showed that pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3 was introduced into NP69 cells. The expression of STGC3 gene in NP69 cell line was significantly decreased, and the cell growth curve was plotted for FCM analysis. In pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69 group, the cell growth and proliferation rate was accelerated. The number of cells in G2 phase and S phase increased significantly compared with the control group. The results of colony formation test showed that the number of cells in G2 phase and S phase was significantly higher than that in control group (P < 0.05). The clone forming ability of pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69 cells was enhanced and the number of colony formation was more. The results of the invasion and metastasis experiment showed that: compared with the control cells. Enhancement of invasion ability of pRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69 cells by p0.001). PRNAT-U6.1/shRNA/STGC3/NP69. The cells of pRNAT-U6.1/scramble/NP69 and NP69 were inoculated subcutaneously in nude mice. After 8 weeks of feeding, no tumor formation was found. Conclusion 1. Eukaryotic expression vector pRNAT-U6.1 / shRNA-STGC3 can effectively reduce the expression of STGC3 gene in NP69 cells. 2. Down-regulating the expression of STGC3 gene in NP69 cells, its growth and proliferation was accelerated, and some malignant transformation was observed, but it was not sufficient for tumorigenesis in nude mice.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1394643