本文關(guān)鍵詞：PinX1基因聯(lián)合順鉑調(diào)控鼻咽癌細胞端粒酶活性、抑制增殖遷移的實驗研究　出處：《南方醫(yī)科大學》2013年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma NPC)是我國南方地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤(發(fā)病率每年在10-150/1001000),也是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,治療上以放療或輔助誘導化療加放療為主,但放化療導致的局部及全身后遺癥嚴重影響了患者的生存質(zhì)量。并且,由于鼻咽癌的發(fā)病部位較為隱蔽,首診時多數(shù)患者已經(jīng)伴有淋巴結(jié)侵襲或和遠處轉(zhuǎn)移,因此,同步放化療成為局部晚期鼻咽癌患者治療的標準方式。但有報道化療耐藥占到惡性腫瘤約75%左右,成為鼻咽癌治療失敗,出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移、影響總體生存率的因素之一。目前,腫瘤多藥耐藥的機制還不清楚,如何逆轉(zhuǎn)耐藥提高治療效果成為鼻咽癌治療領(lǐng)域亟待解決的問題。 腫瘤細胞的多藥耐藥性(multidrug resistance MDR)是指細胞對結(jié)構(gòu)和功能均不同的化療藥物產(chǎn)生的耐藥性,分為原發(fā)性和獲得性耐藥,后者較為常見。研究MDR的分子機制,對于提高鼻咽癌患者的生存率,減少復發(fā)及轉(zhuǎn)移極其重要。一些研究表明,端粒長度/端粒酶活性參與腫瘤MDR。我們課題組曾較為系統(tǒng)探討了端粒酶在鼻咽癌發(fā)病中的作用,發(fā)現(xiàn)端粒酶在鼻咽癌細胞及鼻咽癌CD133+干細胞中高表達,靶向降低端粒酶活性可以明顯抑制鼻咽癌細胞增殖及遷移。 PinXl基因是近年在人和酵母菌細胞中發(fā)現(xiàn)的一個能與端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白,是端粒酶結(jié)合蛋白pin2/TRF1相互作用的一種結(jié)合蛋白,并且是唯一能直接與端粒酶結(jié)合的一種端粒結(jié)合蛋白,高表達PinX1的C-端片段能顯著抑制細胞端粒酶活性,縮短端粒并抑制端粒酶陽性腫瘤細胞在體內(nèi)外生長,被有些學者認為是一種內(nèi)源性的端粒酶抑制劑,我們的前期研究也證實了PinX1能降低鼻咽癌細胞株的端粒酶活性,并促進該腫瘤細胞凋亡的產(chǎn)生。在一系列前期研究工作的基礎(chǔ)上,本研究擬觀察PinXl基因在鼻咽癌細胞化療增敏、逆轉(zhuǎn)化療耐藥中的作用,并進一步探討端粒酶、抗凋亡因子Bc12及耐藥相關(guān)基因LRP在這一過程中的調(diào)控作用。 研究目的 觀察PinX1基因聯(lián)合順鉑對人鼻咽癌細胞生物學特性的影響,為基因聯(lián)合化療減低鼻咽癌化療抵抗提供理論依據(jù)；探討端粒酶活性改變、抗凋亡基因Bcl-2及肺耐藥相關(guān)基因LRP對在上述過程的調(diào)節(jié)作用。 研究內(nèi)容和方法 1、重組慢病毒的構(gòu)建及鑒定 將含PinX1的質(zhì)粒連接到慢病毒穿梭載體上,并經(jīng)雙酶切及測序鑒定確認,與另外兩種輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集并濃縮重組病毒液,用濃度梯度法計算病毒滴度。 2、慢病毒感染鼻咽癌細胞、檢測感染前后PinX1的變化 分別將慢病毒Lenti-PinXl和對照組慢病毒Lenti-Crtl感染過的鼻咽癌細胞命名為Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F細胞。并用熒光定量PCR檢測Lenti-PinXl-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F和5-8F細胞中基因mRNA的表達,Western blotting檢測PinXl蛋白的表達。 3、PinX1聯(lián)合順鉑對鼻咽癌細胞株生物學特性的影響 1)用MTT法檢測不同處理組鼻咽癌細胞株的體外增殖能力 對感染前后的鼻咽癌細胞5-8F和Lenti-PinX1-5-8F加入不同濃度順鉑處理后,酶標儀測570nm處的吸光度即OD(570)值,每組設(shè)置5個復孔,取各復孔的平均值為各組結(jié)果。然后,計算生長抑制率,繪制生長抑制曲線,并據(jù)Q=E(A+B)/(EA+EB-EA*EB)計算PinX1與化療藥間的相互作用。 2) Hoechst33258染色對細胞的凋亡進行形態(tài)學觀察 分別將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F以1×104/ml、500ul/孔接種到24孔板中.培養(yǎng)12h待細胞貼壁后,PBS洗細胞兩次,按實驗分組分別加入500u1全培稀釋的順鉑(16ug/ml)或完全培養(yǎng)基,繼續(xù)置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后,4%多聚甲醛室溫固定細胞、1ug/ml的Hoechst33258染色,熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。 3)流式細胞儀檢測細胞周期 收集對數(shù)生長期的Lenti-PinX1-5-8F和5-8F細胞,PBS洗滌、重懸,調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,取1ml細胞懸液；1000rpm離心5min,棄上清；加入4℃預冷70%乙醇固定,經(jīng)PBS洗滌,加入100ul RnaseA37℃水浴30min；避光加入400ulPI染液4℃避光染色至少30min；流式細胞儀上機檢測 4) Transwell小室檢測不同處理后鼻咽癌細胞的遷移能力 將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F細胞接種到24孔板中,待細胞貼壁后分別給予全培稀釋的16ug/ml順鉑或全培繼續(xù)培養(yǎng)48小時,PBS洗滌細胞,胰酶消化后用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到適當?shù)臐舛确N到上室內(nèi),下室事先加入含20%胎牛血清的全培,37℃,5%CO2培養(yǎng)12小時,將小室置于4%多聚甲醛中固定20min,用棉簽擦去上室內(nèi)細胞,置于1%o結(jié)晶紫染色20-30min,清水漂洗至少3次,吹干后用高倍顯微鏡(400×)隨機取上、下、左、右、中5個視野對細胞進行計數(shù)。 5)劃痕實驗檢測鼻咽癌細胞的愈合能力 將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F接種到6孔板中,待細胞融合度達80%左右時,用200u1的槍頭在每孔中垂直劃“+”,并用PBS洗滌脫落細胞,分別加入無血清培養(yǎng)基稀釋的16ug/ml的順鉑或無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),分別在劃痕后Oh、12h、24h、36h時觀察并拍照,計算愈合率。 4、過表達PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘毎卸肆Ｃ富钚�、Bcl-2和LRP表達的影響 收集對數(shù)生長期的Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞,采用Stretch PCR法檢測端粒酶相對活性,熒光定量PCR和Western blotting檢測Bcl-2和LRP表達情況,進一步了解PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘毎熢雒舻姆肿訖C制。 5、統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件處理包進行數(shù)據(jù)處理分析,參數(shù)比較先進行方差齊性檢測,若方差不齊,用基于方差不齊的近似F檢驗的Welch法。熒光定量PCR、 Western Blotting、端粒酶活性檢測、小室實驗及流式測細胞周期均采用One-Way ANOVA方差分析,方差齊的用LSD法進行多重比較,方差不齊的用Dunnett's T3法進行多重比較。細胞增殖實驗(MTT)和劃痕實驗均采用析因設(shè)計的方差分析。P0.05具有統(tǒng)計學意義,P0.01具有顯著統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果 1、重組慢病毒的構(gòu)建與鑒定 分別用雙酶切及測序鑒定了重組載體的正確,成功獲取了病毒液,病毒滴度為1.3×107IU/ml。 2、重組慢病毒對鼻咽癌細胞的感染及感染前后PinX1的表達變化 慢病毒Lenti-PinX1和對照組慢病毒Lenti-Crtl感染鼻咽癌細胞48h時均可觀察到綠色熒光表達,對照組慢病毒Lenti-Crtl感染組熒光相對較強、較多,隨著時間延長,熒光量均增多、增強,當感染后96h時熒光表達最多,未感染的細胞始終看不到熒光表達；qRT-PCR和Western blotting均顯示Lenti-PinX1-5-8F細胞中PinX1基因較Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞中表達增多。 3. PinX1基因聯(lián)合順鉑對鼻咽癌細胞株生物學特性的影響 MTT檢測顯示PinX1、順鉑單用均能不同程度的抑制鼻咽癌細胞的增殖,但兩者聯(lián)合的增殖抑制能力最為明顯,當PinX1與8-32ug/ml濃度的順鉑聯(lián)合時均出現(xiàn)協(xié)同作用,尤其在16ug/ml濃度時,協(xié)同作用最大�？梢�,PinX1可以增加鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性；Hoechst33258染色進一步從形態(tài)學方面說明PinX1和16ug/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用時核固縮、核碎裂等凋亡細胞更為明顯；流式細胞儀對細胞周期進行檢測,顯示PinXl與16ug/ml的順鉑聯(lián)合能更明顯的將細胞周期阻止在G0/G1期,減少細胞的分裂增殖能力；小室試驗和劃痕試驗也證實PinXl與順鉑的聯(lián)合能顯著抑制細胞的遷移和愈合能力。 4、PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘毎卸肆Ｃ富钚�、抗凋亡基因Bcl-2和肺耐藥相關(guān)基因LRP的影響 Stretch PCR對端粒酶相對活性進行檢測,發(fā)現(xiàn)Lenti-PinX1-5-8F細胞中端粒酶相對活性明顯低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞；qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示,Lenti-PinX1-5-8F中Bcl-2、LRP低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞。 結(jié)論 1、PinX1基因聯(lián)合順鉑能增加對鼻咽癌5-8F細胞的化療敏感性,尤其是PinX1基因與16ug/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用時協(xié)同作用更強,說明聯(lián)合應(yīng)用在增強化療療效的同時,還可以減少順鉑的用藥劑量,這對降低化療藥的全身毒副作用有意義。 2、PinXl基因增加順鉑化療敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥作用有可能是通過下調(diào)鼻咽癌細胞端粒酶活性、抑制Bcl-2和LRP而實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63

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