本文關鍵詞：角膜新生血管微環(huán)境的初步研究　出處：《南京大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的研究骨橋蛋白植入兔角膜后誘導角膜新生血管的形成情況及角膜新生血管周圍微環(huán)境發(fā)生的變化,同時研究人角膜新生血管的微環(huán)境變化特點。探討角膜新生血管的形成機制。方法(一)骨橋蛋白誘導兔角膜新生血管形成及其微環(huán)境的研究第一,建立角膜新生血管動物模型 應用角膜囊袋法制備兔角膜新生血管的動物模型。用5%水合氯醛耳緣靜脈注射麻醉(5ml/Kg體重),倍諾喜(鹽酸奧布卡因滴眼液)滴雙眼角膜表面麻醉。在角膜中央做半厚切口長約3mm,用2mm寬的鞏膜隧道刀逐漸向角膜緣分離并做潛行隧道,隧道頂端距角膜緣2mm。顯微鏡下,將骨橋蛋白緩釋藥丸植入兔左眼角膜囊袋內(nèi)(實驗組為OPN,對照組為PBS)。術畢眼裂涂金霉素眼膏。術后定期觀察、裂隙燈照相及行組織病理學檢查。第二,免疫組織化學方法檢測角膜新生血管周圍微環(huán)境的變化經(jīng)骨橋蛋白誘導的新西蘭大白兔20只,術后3、7、14、21天分別處死5只,取其角膜。對照組(PBS角膜囊袋植入組)20只,與實驗組相同時間點分別處死5只。免疫熒光法檢測兔角膜新生血管模型中α-SMA (α-平滑肌肌動蛋白)的表達情況并觀察其與新生血管的關系。用CD31(血小板內(nèi)皮細胞粘附因子)標記血管內(nèi)皮細胞。免疫組化方法檢測TGF-β1 (轉化生長因子-β1)、VEGF (血管內(nèi)皮細胞生長因子)的表達情況。 第三,分子生物學方法檢測α-SMA及VEGF的表達新鮮角膜組織提取總RNA,采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測α-SMA、VEGF在角膜中不同時間點的表達情況。Western-blot定量檢測角膜新生血管微環(huán)境組分α-SMA、VEGF mRNA及蛋白水平變化。(二)人角膜新生血管微環(huán)境變化的研究具有新生血管的人角膜10只(各種病因導致的角膜新生血管,角膜移植術中取下),對照組為圓錐角膜病人的角膜10只,采用免疫組織化學方法檢測角膜內(nèi)是否存在激活的成纖維細胞標記蛋白FAP(成纖維細胞激活蛋白)的表達以及血管內(nèi)皮標記因子CD31的表達。結果 (一)骨橋蛋白誘導兔角膜新生血管形成及周圍微環(huán)境的變化1.角膜新生血管的形成情況骨橋蛋白緩釋藥丸植入后3天,角膜緣血管向角膜中央長入,角膜緣及結膜血管擴張充血,術后7天新生血管生長旺盛,出現(xiàn)大量角膜新生血管并持續(xù)至術后14天,隨后角膜血管開始退縮減少。病理檢查可見血管生長。對照組角膜未見新生血管的形成。2.免疫組織化學法檢測角膜新生血管微環(huán)境的變化骨橋蛋白緩釋藥丸植入后3、7、14、21天免疫熒光染色顯示：骨橋蛋白誘導組角膜內(nèi)出現(xiàn)α-SMA陽性表達并且其表達水平與新生血管的形成一致,而對照組的正常角膜無陽性表達。免疫組織化學顯示新生血管角膜內(nèi)TGF-β1及VEGF陽性表達,術后7、14天表達量明顯增加,對照組陰性表達。3.分子生物學方法檢測α-SMA、VEGF的表達實時熒光定量RT-PCR及Western-blot結果顯示,術后3、7、14、21天骨橋蛋白誘導組兔角膜均可見α-SMA、VEGF的表達,且術后7、14天α-SMA、VEGF的表達量較高。正常角膜內(nèi)α-SMA、VEGF表達為陰性。(二)人角膜新生血管微環(huán)境變化的研究免疫組織化學染色可見具有新生血管的人角膜FAP及CD31的表達為陽性,對照組角膜未見FAP及CD31的表達。結論骨橋蛋白可以誘導角膜新生血管的形成；在角膜新生血管形成時,其周圍微環(huán)境發(fā)生變化,出現(xiàn)細胞因子、細胞外基質等組分表達的變化,角膜新生血管周圍微環(huán)境對于新生血管的形成起到一定作用。
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R772.2

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