本文關鍵詞：鎖核酸核酶抑制EBV-LMP1基因表達及其對B95-8細胞生物學影響初步研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是我國南方常見的惡性腫瘤，每年新增患者人數(shù)居世界首位。目前認為鼻咽癌病因與EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）密切相關。其中EBV編碼的潛伏膜蛋白1（latent membrane protein1,LMP1）是唯一被證明的致瘤基因。針對EBV-LMP1基因靶向治療成為人們廣泛研究的熱點。鎖核酸核酶(Locked nucleic acid ribozyme， LNAzyme)，是一種在脫氧核酶（Deoxyribozyme，DNAzyme/DZ）基礎上引入一個或幾個鎖核酸（Locked nucleic acid,LNA）單體而形成的特異性切割RNA的新型反義核苷酸。LNA是一種帶雙環(huán)狀結構的寡核苷酸衍生物, LNA的引入使LNAzyme較相應的DZ切割效率明顯提高，特別是與10～23型DNAzyme結合效率最高。 本研究選用課題組前期篩選的針對鼻咽癌EBV-LMP1的高效10～23型DZ167為基礎，經(jīng)LNA修飾設計合成LANzyme，以EBV-LMP1陽性的B95-8細胞為實驗對象，比較DZ167和LNA167對LMP1表達的抑制作用，并觀察其對B95-8細胞生物學的影響。初步探索鎖核酸 目的：根據(jù)前期篩選的脫氧核酶DZ167為基礎，設計合成鎖核酸核酶LAN167，比較DZ167、LAN167對B95-8細胞靶基因EBV-LMP1的抑制效應。 方法：以B95-8為原型，EBV-LMP1基因為抑制靶點，設計合成脫氧核酶DZ167，對其5'端及3'端前2個結合臂分別進行硫代化修飾或引入2個LNA單體，并設計無催化活性中心的無序DNAzyme對照序列，所有序列5'端用FITC標記。經(jīng)脂質(zhì)體轉染B95-8細胞，分為硫代修飾DZ167組（S-DZ167）、鎖核酸核酶LNA167組、無序DZ167組。同時設立未轉染空白對照組。轉染后24h，熒光顯微鏡觀察活細胞中熒光的分布情況，流式細胞儀測轉染率。轉染12h、24h、48h、72h及96h，采用Real-Time PCR評價S-DZ167、LNA167對LMP1穩(wěn)定性及抑制時效關系。轉染后48h采用Western blot方法檢測LNA167、S-DZ167對EBV-LMP1蛋白表達的抑制情況。 結果：轉染后24h，熒光顯微鏡觀察各組均有綠色熒光表達，核酶主要分布于細胞漿、細胞膜。無序DZ167組、S-DZ167組、LNA167組轉染效率分別為75.5%、76.7%及77.6%。 對LMP1穩(wěn)定性及抑制時效關系評價結果示：與未轉染組相比，LNA167組及S-DZ167組于轉染后12h、24h、48h、72h對96h，LMP1均保持一定的抑制效應，抑制率分別為，23.73%，33.93%，44.89%，，27.45%，12.24%；45.76%，51.79%，71.43%，54.90%，22.45%。轉染12h，LNA167及S-DZ167就表現(xiàn)出對LMP1的抑制作用，以48h最明顯，之后逐漸下降；轉染72h后，LNA167組與S-DZ167組抑制率相比，差異有顯著性（P＜0.05）；轉染至96h，仍然表現(xiàn)出對LMP1mRNA一定抑制效應，與未轉染組相比，LNA167組差異有顯著性（P＜0.05），而S-DZ167組差異無顯著性（P＞0.05），兩組相比雖然差異無顯著性（P＞0.05），但LNA167組對LMP1mRNA抑制程度仍高于S-DZ167組。未轉染組與無序DZ167相比差異均無顯著性（P＞0.05）。 Western blot檢測結果顯示：與未轉染組比較，無序DZ167組對EBV-LMP1蛋白表達抑制率為5.89%，差異無顯著性（P＞0.05）；LNA167、S-DZ167對EBV-LMP1蛋白抑制率分別為49%、75.02%，LNA167與S-DZ167能不同程度地抑制EBV-LMP1蛋白，但LNA167抑制效應明顯高于S-DZ167，差異有顯著性（P＜0.05）。 結論：LNA167、S-DZ167對EBV-LMP1表達的抑制作用呈一定時效關系，48h抑制作用達高峰，以后逐漸下降，但LNA167抑制效應均高于S-DZ167；與S-DZ167相比，經(jīng)LNA修飾的LNA167能高效抑制EBV-LMP1基因的表達； 目的：探討鎖核酸核酶靶向抑制LMP1后，對細胞毒性、增值活性、致瘤能力、凋亡的影響。 方法：將無序DZ167、S-DZ167及LNA167經(jīng)脂質(zhì)體分別轉染EBV-LMP1陽性B95-8細胞、EBV-LMP1陰性的鼻咽癌CNE-2細胞，同時設立未轉染的B95-8、CNE-2細胞為空白對照。轉染24h、48h、72h后，采用CCK8法評價不同濃度S-DZ167、LNA167對CNE-2細胞毒性；轉染24h、48h、72h后，CCK8檢測各轉染組對B95-8細胞增值活性影響；轉染14d后，觀察B95-8細胞在軟瓊脂中克隆形成情況；轉染48h，流式細胞儀Annexing V-FITC/PI檢測各轉染組B95-8細胞的凋亡情況。 結果：細胞毒性結果顯示：分別以2.0umol/L、5.0umol/L的LNA167及DZ167轉染CNE-2細胞，與未轉染組相比，不同濃度的抑制劑，在同一時間點對細胞增殖活性均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），轉染前后細胞形態(tài)未見明顯變化； CCK8細胞增值活性結果顯示：轉染24h，S-DZ167組及LNA167增值抑制率分別為23.52%、29.41%，與未轉染組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。轉染48h，各組抑制效率達最高，S-DZ167組及LNA167抑制率分別為，26.57%、62.74%，LNA167顯著高于S-DZ167組，差異有顯著性（P＜0.05）。轉染至72h，LNA167組及S-DZ167組對B95-8的增值抑制效率逐漸降低，與未轉染組比較，差異有顯著性（P＜0.05），抑制效應LNA167組＞S-DZ167組。 軟瓊脂克隆形成結果，培養(yǎng)4～5d左右，未轉組及無序DZ167組細胞開始聚攏形成克隆,形態(tài)較小。此時，LNA167組和S-DZ167組均未見克隆形成，增值能力及致瘤性明顯減弱。培養(yǎng)至14d時， LNA167組、S-DZ167組、無序DZ167組及未轉組形成的克隆數(shù)分別為15±1.67、32±2.31、62±5.13、58±2.36，克隆率分別為3%、6.4%、12.4%、11.6%，與未轉組比較，LNA167組、S-DZ167組差異有顯著習慣（P＜0.05）。無序DZ167組與未轉組比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。 流式細胞儀檢測凋亡率，轉染48h后，無序DZ167組凋亡率為0.4%，與未轉染對照組相比，差異無顯著性（P＞0.05），而LNA167組、S-DZ167組凋亡率分別為24.16%、19.55%，與未轉染對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。凋亡抑制效應：LNA167組＞DZ167組＞無序DZ167組。 結論： LNA167、S-DZ167對細胞的正常增值活性無明顯毒性，與S-DZ167相比，LNA167能明顯抑制EBV-LMP1細胞的增值活性、使細胞致瘤能力明顯下降，誘導細胞凋亡。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1308360