本文關(guān)鍵詞：αA晶體蛋白基因啟動子與HSP70基因融合表達(dá)載體構(gòu)建及其在半乳糖誘導(dǎo)大鼠晶狀體組織的表達(dá)

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【摘要】：目的：構(gòu)建aA晶體蛋白基因啟動子(aACP)與HSP70基因融合表達(dá)載體paACP-HSP70,并檢測其在半乳糖誘導(dǎo)的大鼠晶狀體組織的表達(dá)及其對半乳糖誘導(dǎo)大鼠晶狀體組織抗氧化系統(tǒng)的作用。 方法：利用PCR技術(shù)從pIRES2-EGFP-HSP70中擴(kuò)增HSP70,用Xho I和BamH I分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和paACP-IRES2-EGFP載體,回收目的片段再連接構(gòu)建aACP啟動子啟動的含HSP70基因的特異性表達(dá)載體paACP-HSP70,通過酶切、PCR檢測及測序證實其構(gòu)建成功。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pIRES2-EGFP、 pIRES2-EGFP-HSP70、paACP-HSP70分別導(dǎo)入半乳糖誘導(dǎo)的大鼠晶狀體組織,以生理鹽水作為空白對照。通過熒光顯微鏡直接觀察綠色熒光蛋白基因(EGFP)的表達(dá),western blot檢測HSP70基因在大鼠晶狀體組織中的表達(dá)；用SOD試劑盒及GSH-Px試劑盒分別檢測晶狀體抗氧化系統(tǒng)中SOD、GSH-Px活性的變化。 結(jié)果：(1)構(gòu)建的paACP-HSP70質(zhì)粒通過酶切圖譜鑒定、PCR檢測有1924bp條帶出現(xiàn),通過測序顯示所克隆的HSP70基因與基因庫中的同種序列比較,核苷酸序列有100%的同源性。(2)pIRES2-EGFP組、pHSP70組、paACP-HSP70組在大鼠晶狀體組織均可直接觀察到綠色熒光,且paACP-HSP70組熒光強(qiáng)度最強(qiáng),與pIRES2-EGFP組、pHSP70組的差異均有顯著性(P0.01),NS組未見熒光蛋白表達(dá)。(3) western blot檢測顯示外源性HSP70基因可在大鼠晶狀體組織表達(dá)。(4)在高糖刺激下晶狀體中SOD及GSH-Px活力明顯下降,paACP-HSP70組與其他組相比SOD、GSH-Px的活性顯著升高(P0.01),與NS組比較分別增加了1.41倍和13.65倍。 結(jié)論：成功構(gòu)建了晶狀體上皮細(xì)胞特異性表達(dá)載體paACP-HSP70;該表達(dá)載體導(dǎo)入大鼠晶狀體組織內(nèi)可表達(dá)外源性HSP70基因；外源性HSP70能改善高糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障的晶狀體的抗氧化系統(tǒng)活力。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R776.1

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本文編號：1305722