本文關(guān)鍵詞：鋅指蛋白488在鼻咽癌中的表達(dá)及功能機(jī)制的研究

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【摘要】：第一部分 ZNF488對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株HONE1生物學(xué)行為的影響目的：探討ZNF488基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞HONE1生物學(xué)行為的影響。方法：構(gòu)建攜帶空載體、人ZNF488基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMSCV和pMSCV-ZNF488,以磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞并收集病毒液,感染鼻咽癌細(xì)胞株HONEl,經(jīng)嘌呤霉素篩選及Western-blotting鑒定,建立穩(wěn)定表達(dá)ZNF488的HONEl-pMSCV-ZNF488和空載體HONE1-pMSCV的細(xì)胞株。應(yīng)用噻唑鹽(MTT)法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測ZNF488過表達(dá)對(duì)HONE1細(xì)胞生長增殖的影響,同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測ZNF488對(duì)細(xì)胞周期增殖指數(shù)的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察ZNF488對(duì)HONE1遷移侵襲能力的影響。Western-blotting檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白及抑癌基因PTEN的表達(dá)情況。結(jié)果：成功建立HONE1-pMSCV 和 HONEl-pMSCV-ZNF488穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,MTT法及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載體組HONE1-pMSCV細(xì)胞相比,HONE1-pMSCV-ZNF488細(xì)胞增殖及克隆形成能力均增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)顯示過表達(dá)ZNF488細(xì)胞S期百分比較空載體組高,增殖指數(shù)增加。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)示ZNF488能夠顯著增加細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志E-Cadhesion、a-Catenin表達(dá)降低,間質(zhì)性標(biāo)志Fibronectin、Vimentin表達(dá)升高,同時(shí)抑癌因子PTEN表達(dá)下降。結(jié)論：過表達(dá)ZNF488可通過誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞HONE1發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變及下調(diào)抑癌基因PTEN,促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移侵襲能力。第二部分ZNF488在鼻咽癌中的表達(dá)、功能及分子機(jī)制的研究目的：1、檢測ZNF488在鼻咽癌中的表達(dá),并明確其與預(yù)后的關(guān)系。2、探索ZNF488對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株功能的影響,并進(jìn)行分子機(jī)制的研究。方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ZNF488在鼻咽癌組織、正常鼻咽組織、鼻咽癌細(xì)胞、正常鼻咽上皮細(xì)胞及永生化細(xì)胞中表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)檢測ZNF488在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況。構(gòu)建ZNF488過表達(dá)細(xì)胞株后,劃痕試驗(yàn)及Transwell試驗(yàn)檢測ZNF488對(duì)遷移和侵襲功能的影響。同時(shí)利用小分子RNA (SiRNA)技術(shù)基因敲除內(nèi)源性ZNF488,進(jìn)一步對(duì)功能進(jìn)行驗(yàn)證。Western blotting在蛋白水平上檢測上皮標(biāo)志物及間質(zhì)標(biāo)志物,免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證上皮及間質(zhì)標(biāo)志物伴隨ZNF488過表達(dá)之后的變化。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)在體外及體內(nèi)水平檢測ZNF488對(duì)成瘤能力的影響�；蛐酒瑢�(duì)比兩對(duì)細(xì)胞株基因表達(dá)差異,并進(jìn)行聚類分析。熒光素報(bào)告基因檢測核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性。Western blotting檢測通路蛋白的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)方法如下：Student's T檢驗(yàn),X2檢驗(yàn),Kaplan-Meier生存分析,log-rank檢驗(yàn),并應(yīng)用回歸風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果：ZNF488在鼻咽癌組織中表達(dá)水平高于正常鼻咽上皮組織,在鼻咽癌細(xì)胞株中普遍呈高表達(dá),且在鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和S18兩株具有高轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞株中明顯呈高表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,ZNF488高表達(dá)區(qū)域主要位于癌巢前緣。生存分析研究表明,高表達(dá)ZNF488的患者,其總生存、無進(jìn)展生存、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存及無局部區(qū)域復(fù)發(fā)生存均明顯低于低表達(dá)ZNF488的患者。功能實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)ZNF488后,鼻咽癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力均增加,而基因敲除ZNF488后,高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的遷移及侵襲能力均減弱。過表達(dá)ZNF488后,鼻咽癌細(xì)胞的體內(nèi)體外成瘤能力均增加。機(jī)制研究表明,ZNF488上調(diào)了β-Catenin、 p-GSK3β、Smad4、Snail和Slug表達(dá),通過激活VVNT/β-Catenin及TGF-β/Smad4通路,兩者共同作用下激活核轉(zhuǎn)移因子TCF/LEF,從而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變。結(jié)論：ZNF488在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中作為癌基因,通過激活WNT/β-Cate min及TGF-β/Smad4通路,激活核轉(zhuǎn)移因子TCF/LEF,而誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變,從而參與鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移過程。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63

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