本文關鍵詞：鋅指蛋白488在鼻咽癌中的表達及功能機制的研究

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【摘要】：第一部分 ZNF488對鼻咽癌細胞株HONE1生物學行為的影響目的：探討ZNF488基因對鼻咽癌細胞HONE1生物學行為的影響。方法：構建攜帶空載體、人ZNF488基因的逆轉錄病毒質粒pMSCV和pMSCV-ZNF488,以磷酸鈣法轉染293FT細胞并收集病毒液,感染鼻咽癌細胞株HONEl,經(jīng)嘌呤霉素篩選及Western-blotting鑒定,建立穩(wěn)定表達ZNF488的HONEl-pMSCV-ZNF488和空載體HONE1-pMSCV的細胞株。應用噻唑鹽(MTT)法、平板克隆形成實驗檢測ZNF488過表達對HONE1細胞生長增殖的影響,同時應用流式細胞術檢測ZNF488對細胞周期增殖指數(shù)的影響。劃痕實驗及Transwell體外侵襲實驗觀察ZNF488對HONE1遷移侵襲能力的影響。Western-blotting檢測上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關蛋白及抑癌基因PTEN的表達情況。結果：成功建立HONE1-pMSCV 和 HONEl-pMSCV-ZNF488穩(wěn)定表達細胞株,MTT法及平板克隆形成實驗結果顯示,與空載體組HONE1-pMSCV細胞相比,HONE1-pMSCV-ZNF488細胞增殖及克隆形成能力均增強。流式細胞術顯示過表達ZNF488細胞S期百分比較空載體組高,增殖指數(shù)增加。劃痕實驗、Transwell體外侵襲實驗示ZNF488能夠顯著增加細胞的遷移、侵襲能力。Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)上皮標志E-Cadhesion、a-Catenin表達降低,間質性標志Fibronectin、Vimentin表達升高,同時抑癌因子PTEN表達下降。結論：過表達ZNF488可通過誘導鼻咽癌細胞HONE1發(fā)生上皮間質轉變及下調抑癌基因PTEN,促進細胞的增殖及遷移侵襲能力。第二部分ZNF488在鼻咽癌中的表達、功能及分子機制的研究目的：1、檢測ZNF488在鼻咽癌中的表達,并明確其與預后的關系。2、探索ZNF488對鼻咽癌細胞株功能的影響,并進行分子機制的研究。方法：實時熒光定量PCR檢測ZNF488在鼻咽癌組織、正常鼻咽組織、鼻咽癌細胞、正常鼻咽上皮細胞及永生化細胞中表達情況。免疫組織化學檢測ZNF488在鼻咽癌組織中的表達情況。構建ZNF488過表達細胞株后,劃痕試驗及Transwell試驗檢測ZNF488對遷移和侵襲功能的影響。同時利用小分子RNA (SiRNA)技術基因敲除內(nèi)源性ZNF488,進一步對功能進行驗證。Western blotting在蛋白水平上檢測上皮標志物及間質標志物,免疫熒光進一步驗證上皮及間質標志物伴隨ZNF488過表達之后的變化。平板克隆形成實驗、軟瓊脂平板克隆形成實驗及裸鼠體內(nèi)成瘤實驗在體外及體內(nèi)水平檢測ZNF488對成瘤能力的影響�；蛐酒瑢Ρ葍蓪毎昊虮磉_差異,并進行聚類分析。熒光素報告基因檢測核轉錄因子TCF/LEF的轉錄活性。Western blotting檢測通路蛋白的表達情況。統(tǒng)計方法如下：Student's T檢驗,X2檢驗,Kaplan-Meier生存分析,log-rank檢驗,并應用回歸風險模型進行多因素分析。結果：ZNF488在鼻咽癌組織中表達水平高于正常鼻咽上皮組織,在鼻咽癌細胞株中普遍呈高表達,且在鼻咽癌細胞株5-8F和S18兩株具有高轉移特性的細胞株中明顯呈高表達。免疫組織化學結果顯示,ZNF488高表達區(qū)域主要位于癌巢前緣。生存分析研究表明,高表達ZNF488的患者,其總生存、無進展生存、無遠處轉移生存及無局部區(qū)域復發(fā)生存均明顯低于低表達ZNF488的患者。功能實驗表明,過表達ZNF488后,鼻咽癌細胞的遷移及侵襲能力均增加,而基因敲除ZNF488后,高轉移細胞株的遷移及侵襲能力均減弱。過表達ZNF488后,鼻咽癌細胞的體內(nèi)體外成瘤能力均增加。機制研究表明,ZNF488上調了β-Catenin、 p-GSK3β、Smad4、Snail和Slug表達,通過激活VVNT/β-Catenin及TGF-β/Smad4通路,兩者共同作用下激活核轉移因子TCF/LEF,從而誘導鼻咽癌細胞發(fā)生上皮間質轉變。結論：ZNF488在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中作為癌基因,通過激活WNT/β-Cate min及TGF-β/Smad4通路,激活核轉移因子TCF/LEF,而誘導鼻咽癌細胞發(fā)生上皮間質轉變,從而參與鼻咽癌的侵襲與轉移過程。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

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