本文關鍵詞：人β-NGF重組質粒轉染GFP轉基因的小鼠骨髓基質干細胞的實驗研究

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【摘要】：目的：構建、并觀察攜帶人-β-NGF（nervegrowthfactor,神經生長因子）重組質粒的骨髓基質干細胞（bonemarrowstromalstemcell,BMSC）的生物學特性，，為應用β-NGF修飾的BMSC進行耳蝸移植治療老年聾的動物實驗研究提供支持。方法：將含有重組質粒的陽性克隆大腸桿菌接種至37℃預溫的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)24小時進行細菌擴增，取擴增好的菌夜按質粒提取試劑盒說明提取重組質粒，提取成功后對其進行HindIII、XhoI雙酶切鑒定，-20℃保存?zhèn)溆�。復蘇小鼠骨髓基質干細胞，流式細胞學鑒定其表面CD標記，然后將GFP轉基因的小鼠骨髓基質干細胞分為四組：A組為脂質體2000包裹的重組質粒轉染組；B組為脂質體轉染組；C組為脂質體包裹的空質粒轉染組；D組為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的陰性對照組。采用脂質體LipofectamineTM2000轉染方法將含有人β-NGF神經生長因子的重組質粒轉染至含有GFP基因的小鼠骨髓基質干細胞中，在倒置光學顯微鏡下對比各組細胞的數量及觀察細胞突起的生長情況，收集各組細胞的上清液，分別利用酶聯(lián)免疫吸附實驗的方法檢測各組細胞培養(yǎng)液中人-β-NGF基因的表達情況。結果：重組質粒pcDNA3-β-NGF經限制性內切酶HindIII和XhoI雙酶切后，限制性內酶切片段長度與插入基因片段相符約725bp；將重組質粒按脂質體LipofectamineTM2000操作說明書進行轉染，倒置光學顯微鏡下觀察到各組細胞生長情況不同：實驗組細胞生長狀態(tài)良好，而脂質體轉染組及空質粒組細胞生長狀態(tài)較差，大量細胞出現胞膜不明顯，細胞核碎裂，細胞形態(tài)混亂，空白對照組細胞無明顯改變。于轉染后48小時換液，收集各組細胞上清液，并用ELISA測定各組中是否有人-β-NGF蛋白的表達情況。NGF蛋白ELISA檢測結果：A、重組質粒組為174.91±4.71pg/ml，B、空質粒組為5.94±0.91pg/ml，C、Lip2000組為5.71±0.50pg/ml，D、陰性對照組為5.79±0.80pg/ml，重組質粒組NGF蛋白表達量明顯比其他各組NGF蛋白表達量高。結論：采用脂質體LipofectamineTM2000轉染方法能成功的將NGF重組質粒轉染至骨髓基質干細胞，經轉染后攜帶NGF質粒的小鼠骨髓基質干細胞仍有增殖、分化能力，并且具有了NGF蛋白的表達能力，其表達的NGF蛋白能有效的保護轉染過程中對細胞的損害，這些研究結果，可以為我們下一步應用β-NGF修飾的BMSC進行耳蝸移植治療老年聾的動物實驗研究提供基礎。
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R764.436

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本文編號：1232057