本文關(guān)鍵詞：人β-NGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 人-β-NGF GFP Lip2000 轉(zhuǎn)染 小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

【摘要】：目的：構(gòu)建、并觀察攜帶人-β-NGF（nervegrowthfactor,神經(jīng)生長(zhǎng)因子）重組質(zhì)粒的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowstromalstemcell,BMSC）的生物學(xué)特性，，為應(yīng)用β-NGF修飾的BMSC進(jìn)行耳蝸移植治療老年聾的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供支持。方法：將含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆大腸桿菌接種至37℃預(yù)溫的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)增，取擴(kuò)增好的菌夜按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明提取重組質(zhì)粒，提取成功后對(duì)其進(jìn)行HindIII、XhoI雙酶切鑒定，-20℃保存?zhèn)溆�。�?fù)蘇小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞學(xué)鑒定其表面CD標(biāo)記，然后將GFP轉(zhuǎn)基因的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分為四組：A組為脂質(zhì)體2000包裹的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；B組為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組；C組為脂質(zhì)體包裹的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；D組為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組。采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法將含有人β-NGF神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至含有GFP基因的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中，在倒置光學(xué)顯微鏡下對(duì)比各組細(xì)胞的數(shù)量及觀察細(xì)胞突起的生長(zhǎng)情況，收集各組細(xì)胞的上清液，分別利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中人-β-NGF基因的表達(dá)情況。結(jié)果：重組質(zhì)粒pcDNA3-β-NGF經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切后，限制性內(nèi)酶切片段長(zhǎng)度與插入基因片段相符約725bp；將重組質(zhì)粒按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察到各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況不同：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，大量細(xì)胞出現(xiàn)胞膜不明顯，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞形態(tài)混亂，空白對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯改變。于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)換液，收集各組細(xì)胞上清液，并用ELISA測(cè)定各組中是否有人-β-NGF蛋白的表達(dá)情況。NGF蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果：A、重組質(zhì)粒組為174.91±4.71pg/ml，B、空質(zhì)粒組為5.94±0.91pg/ml，C、Lip2000組為5.71±0.50pg/ml，D、陰性對(duì)照組為5.79±0.80pg/ml，重組質(zhì)粒組NGF蛋白表達(dá)量明顯比其他各組NGF蛋白表達(dá)量高。結(jié)論：采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染方法能成功的將NGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染后攜帶NGF質(zhì)粒的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞仍有增殖、分化能力，并且具有了NGF蛋白的表達(dá)能力，其表達(dá)的NGF蛋白能有效的保護(hù)轉(zhuǎn)染過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害，這些研究結(jié)果，可以為我們下一步應(yīng)用β-NGF修飾的BMSC進(jìn)行耳蝸移植治療老年聾的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R764.436

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本文編號(hào)：1232057