本文關(guān)鍵詞：STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的鑒定

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【摘要】：目的：應(yīng)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；利用電泳遷移率變動(dòng)分析和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，鑒定該基因核心啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；運(yùn)用RT-PCR和Western blot技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1在NPC細(xì)胞中的表達(dá)水平，揭示STGC3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制。 方法：本研究在前期研究的工作基礎(chǔ)上，運(yùn)用生物信息學(xué)在線軟件，預(yù)測(cè)STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)(-934bp/-653bp)序列上可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，按照轉(zhuǎn)錄因子Sp1位點(diǎn)所在的DNA序列，分別制備三種探針：即生物素標(biāo)記的野生型探針、生物素標(biāo)記的突變型探針、未標(biāo)記的野生型探針；提取CNE2細(xì)胞核蛋白，電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，體外鑒定Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；染色質(zhì)免疫共沉淀分析(ChIP)，體內(nèi)鑒定Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；采用RT-PCR及Western blot技術(shù)，從mRNA及蛋白質(zhì)水平，檢測(cè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子在不同細(xì)胞系中的表達(dá)。 結(jié)果：生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示-934bp至-653bp區(qū)域共存在AP-1、Sp1、GAL4、HNF-3B和C/EBPalp等21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中9個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；嚴(yán)格設(shè)定參數(shù)后，該區(qū)域區(qū)僅含有5個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中2個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)CNE2細(xì)胞核中存在與轉(zhuǎn)錄因子Sp1相結(jié)合的蛋白質(zhì)，此種結(jié)合具有特異性；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CNE2細(xì)胞(STGC3基因高表達(dá))較NP69細(xì)胞(STGC3基因低表達(dá))Sp1在mRNA水平的表達(dá)明顯增高，，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CNE2細(xì)胞中Sp1在蛋白水平的表達(dá)明顯高于與NP69細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論： 1. STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1的特異性結(jié)合位點(diǎn)。 2.在CNE2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子Sp1負(fù)性調(diào)控STGC3基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1219272