本文關鍵詞：恒河猴骨髓間充質干細胞體內及體外誘導為角膜內皮細胞的研究

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【摘要】：目的將體外培養(yǎng)的恒河猴骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植于角膜內皮細胞失代償?shù)慕悄缺砻?分時段觀察細胞形態(tài)及功能改變,分析體內誘導BMSCs致角膜內皮細胞化的可行性。同時對BMSCs誘導為角膜內皮細胞(Corneal endothelial cells, CECs)的體外環(huán)境條件進行初步探索。 方法恒河猴8只,隨機分為兩組：實驗組(6只)、對照組(2只)；應用超聲乳化技術破壞CECs制作角膜內皮細胞功能失代償模型。采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)幼猴BMSCs,經(jīng)鑒定、Brdu標記后應用前房注射法移植入損傷后的角膜內表面。術后觀察角膜透明度、眼壓、角膜水腫程度、角膜及虹膜有無新生血管、前房深度、瞳孔大小、房水渾濁程度,主觀上觀察BMSCs移植后對正常角膜組織結構及代謝功能的影響；術后1月、2月、3月摘取術眼角膜植片進行病理切片(HE染色)、掃描電鏡及透射電鏡檢測,從客觀上觀察替代移植后BMSCs的分布狀況、形態(tài)學改變、連接狀態(tài)及生長趨勢；行抗Brdu單克隆抗體免疫組織化學染色及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組織化學染色,以判斷角膜植片內表面的細胞是否為移植的細胞,以及移植后的細胞是否表達角膜內皮細胞特異性表面分子。揭膜消化法分離培養(yǎng)幼猴角膜內皮細胞,形態(tài)學觀察及NSE免疫組化染色法進行鑒定；采用BMSCs和CECs置于Transwell非接觸共同培養(yǎng)體系以及應用含有角膜內皮失代償恒河猴前房水的培養(yǎng)基對BMSCs進行培養(yǎng)兩種方式對BMSCs進行體外誘導,觀察BMSCs形態(tài)學變化并采用NSE免疫組織化學染色行細胞鑒定。 結果超聲乳化損傷角膜內皮后成功建立了角膜內皮功能失代償模型,角膜透明度逐漸下降。實驗組BMSCs移植入前房后,實驗組角膜透明度于2周后開始逐漸增加。電鏡觀察見：1月時細胞成疊加生長,細胞間連接較少；2月時細胞間連接較前增加；3月時細胞類似單層生長,細胞間連接較多,但存在細胞窗；形態(tài)上細胞逐漸由長梭形向短梭形及多邊形靠攏。對照組角膜混濁不能恢復,可見新生血管長入；電鏡下觀察見后彈力層裸露,無細胞覆蓋,偶可見殘存角膜內皮細胞,貼附不牢固。體外誘導的兩種方法：Transwell共培養(yǎng)法及房水-培養(yǎng)基誘導法,分別于第3周及第2周采用NSE法鑒定出陽性結果,細胞形態(tài)上改變不甚明顯；重復誘導一次結果相同。 結論體外培養(yǎng)的同種異體BMSCs采用改良的前房注射法植入損傷后的恒河猴角膜內表面后可在一定程度上替代角膜內皮細胞,發(fā)揮它的泵功能,且能部分表達內皮細胞表面相關蛋白。Transwell非接觸共培養(yǎng)及房水-培養(yǎng)基法均可體外誘導BMSCs分化為角膜內皮樣細胞。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R772.2

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