本文關(guān)鍵詞：西北地區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的高通量表達(dá)篩選和功能研究

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【摘要】：背景和目的： 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因，其分子機(jī)制有待深入探索。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟相互作用的復(fù)雜過程。高通量的表達(dá)篩選是發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的重要方法，但目前鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選大多來源于細(xì)胞系，無法真實(shí)模擬體內(nèi)的情況，另外，大多數(shù)的研究來自于鼻咽癌高發(fā)區(qū)，非高發(fā)區(qū)的研究相對較少。本研究首次利用鼻咽癌轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本，利用全基因組表達(dá)譜芯片芯片篩選中國西北地區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并分別在細(xì)胞系的mRNA、蛋白水平及組織標(biāo)本中進(jìn)行表達(dá)和功能驗(yàn)證。本研究將有望發(fā)現(xiàn)多個(gè)新的非高發(fā)區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)重要基因，為鼻咽癌轉(zhuǎn)移的臨床診治提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1、臨床標(biāo)本選取西北地區(qū)以轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀的和隨訪滿3年無轉(zhuǎn)移的鼻咽癌原發(fā)灶組織各3例，采用含41,000個(gè)人類功能基因的安捷倫全基因組表達(dá)譜芯片檢測，比較兩組基因表達(dá)譜的差異性，篩選具有2倍以上表達(dá)差異的基因，使用GoMiner軟件分析差異基因的功能；使用KEGG軟件對差異基因進(jìn)行通路分析。 2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)染色的方法對候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的進(jìn)行mRNA及蛋白水平的驗(yàn)證，以確定芯片結(jié)果的可靠性，同時(shí)利用Western blot檢測不同轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞系（5-8F和6-10B細(xì)胞）各候選基因的表達(dá)情況。 3、采用siRNA技術(shù)干擾候選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MAZ、DMBT1基因在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8F和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系6-10B中的表達(dá)，Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)觀察5-8F、6-10B細(xì)胞株遷移、侵襲能力的變化，探討MAZ、DMBT1對5-8F及6-10B細(xì)胞系轉(zhuǎn)移表型的影響。 4、收集鼻咽癌患者的組織標(biāo)本，利用免疫組化檢測MAZ和DMBT1基因的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床資料的相關(guān)性，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組基因表達(dá)譜結(jié)果：按差異倍數(shù)2倍，F(xiàn)DR10%標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織相比，有2314個(gè)基因上調(diào)，2417個(gè)基因下調(diào)。采用差異倍數(shù)10倍為標(biāo)準(zhǔn)篩選，70個(gè)基因上調(diào)，57個(gè)基因下調(diào)。本研究首次發(fā)現(xiàn)MAZ、DMBT1、SFTPB三個(gè)基因在非高發(fā)區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組的差異表達(dá)，是潛在的鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。 2、通過GoMiner和KEGG對差異倍數(shù)達(dá)2倍以上的基因進(jìn)行GO分析和通路分析發(fā)現(xiàn)：上調(diào)基因共參與501個(gè)BP分類，參與125個(gè)CC分類，參與98個(gè)MF分類；下調(diào)基因參與333個(gè)BP分類，37個(gè)CC分類，72個(gè)MF分類。Pathway分析顯示轉(zhuǎn)移上調(diào)基因共參與35條pathway，下調(diào)基因共參與29條pathway，P值均0.05。 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化檢測組織中MAZ、DMBT1、SFTPB的表達(dá)與芯片結(jié)果具有良好的一致性，高轉(zhuǎn)移組織中MAZ表達(dá)上調(diào)，DMBT1、SFTPB下調(diào)。Western Blot檢測高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系5-8F細(xì)胞中MAZ的表達(dá)上調(diào)，DMBT1、SFTPB表達(dá)下調(diào)，低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系6-10B細(xì)胞中MAZ表達(dá)下調(diào)，DMBT1、SFTPB上調(diào)。 4、用MAZ和DMBT1的siRNA分別轉(zhuǎn)染5-8F、6-10B細(xì)胞，Western Blot檢測證實(shí)轉(zhuǎn)染后其蛋白表達(dá)明顯降低。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染MAZ siRNA后，5-8F細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯減弱；轉(zhuǎn)染DMBT1siRNA后，6-10B細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)。 5、免疫組化檢測MAZ和DMBT1表達(dá)與鼻咽癌臨床資料相關(guān)性，，結(jié)果提示：在遠(yuǎn)轉(zhuǎn)組、N分期晚、T分期晚、未分化型癌的病人中，MAZ表達(dá)較高（P 0.05），DMBT1在未轉(zhuǎn)移組、分化型，其表達(dá)量較高（P0.05）。SFTPB在轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組、不同T、N、臨床分期、病理類型之間表達(dá)差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 通過全基因組芯片篩選技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)MAZ、DMBT1、SFTPB這三個(gè)基因可能是西北非高發(fā)區(qū)鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要基因。我們進(jìn)一步對MAZ和DMBT1基因進(jìn)行了深入研究。其中，MAZ是潛在的促鼻咽癌轉(zhuǎn)移基因，其在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高，下調(diào)MAZ的表達(dá)，可以顯著抑制高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。DMBT1是潛在的鼻咽癌轉(zhuǎn)移抑制基因，其在低轉(zhuǎn)移的組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)DMBT1的表達(dá)可以顯著促進(jìn)低轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力。臨床資料的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：MAZ在未分化鼻咽癌的表達(dá)水平較高，且其高表達(dá)和鼻咽癌的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。DMBT1在分化型鼻咽癌的表達(dá)水平較高，且其低表達(dá)和鼻咽癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 葉偉軍;閔華慶;曹新平;陳昆田;侯景輝;李楊;;P53蛋白、血管內(nèi)皮生長因子等生物分子指標(biāo)與鼻咽癌放射敏感性的關(guān)系[J];癌癥;2006年09期

2 胡春芳;邵瓊;侯景輝;邵建永;;VEGF在鼻咽癌中的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系[J];中國腫瘤;2006年07期

3 羅均利,肖健云,陶正德,李曉燕;Detection of c-myc gene expression in nasopharyngeal carcinoma by nonradioactive in situ hybridization and immunohistochemistry[J];Chinese Medical Journal;1997年03期

4 張光斌;賀濤;張寧;;DMBT1過表達(dá)對食管癌細(xì)胞系EC9706生物學(xué)行為的影響[J];世界華人消化雜志;2009年17期

本文編號(hào)：1156577