本文關(guān)鍵詞：磷酸化15位點(diǎn)絲氨酸對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用

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【摘要】：背景： 先天性白內(nèi)障是導(dǎo)致兒童失明的主要原因，大約0.3-1.5/1000的兒童患有先天性白內(nèi)障，其主要病理改變?yōu)榫铙w發(fā)育遲緩、晶狀體內(nèi)非透明瘢塊組織形成。染色體異常為先天性白內(nèi)障的主要致病原因[1]，大量研究證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子基因突變和功能缺陷是誘發(fā)先天性白內(nèi)障的遺傳病因之一，如Pax6、FoxE3、Six3、Prox1、Sox2/3、Maf、Pitx3、AP-2a和Hsf4[2-4]。在正常情況下，這些轉(zhuǎn)錄因子的瞬時(shí)激活和滅活決定晶狀體不同發(fā)育階段，如Pax6在胚胎早期neuronal ectodem的表面細(xì)胞內(nèi)被激活，促使外胚層上皮細(xì)胞形成晶狀體placode和晶狀體vesicle結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向初級(jí)纖維細(xì)胞分化、調(diào)控δ-crystallin和alpha A-crystallin等多種蛋白的表達(dá)[5,6]。出生后隨著晶狀體的成熟，Pax6轉(zhuǎn)錄活性被抑制。Pax6基因突變與臨床先天遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)[7]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(Hsf4)是調(diào)控新生兒期晶狀體發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，Hsf4蛋白在胚胎E13.5晶狀體組織內(nèi)開始表達(dá)，在新生兒期（P1-P28）達(dá)到高峰，隨著晶狀體成熟而逐漸減少[8-10]。Hsf4DNA結(jié)合域密碼錯(cuò)義突變(如L115P、I87V、A20D和H74R)與中國和丹麥家族常染色體顯性遺傳性lamellar型白內(nèi)障[4]，以及中國家族性顯性遺傳性總白內(nèi)障(total white cataract)的發(fā)生密切相關(guān)[11]。敲除小鼠Hsf4基因可誘發(fā)新生期小鼠先天性白內(nèi)障，主要病理改變?yōu)榫铙w前囊上皮非正常增生、纖維細(xì)胞內(nèi)變性蛋白堆積和纖維細(xì)胞終末分化障礙[8-10]。因此認(rèn)為Hsf4轉(zhuǎn)錄活性對(duì)維持新生兒期晶狀體正常發(fā)育至關(guān)重要。 Hsf4是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在機(jī)體內(nèi)有兩種亞型Hsf4a和Hsf4b.它們來源于同一個(gè)基因的不同mRNA剪輯過程。 Hsf4a和Hsf4b因結(jié)構(gòu)不同造成其轉(zhuǎn)錄活性相反。Hsf4a為轉(zhuǎn)錄抑制子，而Hsf4b則為轉(zhuǎn)錄激活子。晶狀體中只有Hsf4b這一種活性形式。它主要參與調(diào)控小分子熱休克蛋白（Hsp25, r-crstallin, a-crystallin和纖維細(xì)胞骨架蛋白（imentin，filesin)等蛋白的表達(dá)。其轉(zhuǎn)錄活性受磷酸化調(diào)控。但是磷酸化調(diào)控Hsf4轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)理和相關(guān)信號(hào)通路不清楚。探討Hsf4b磷酸化調(diào)控機(jī)理對(duì)揭示Hsf4轉(zhuǎn)錄功能障礙而誘發(fā)先天白內(nèi)障的機(jī)理具有重要意義。我們應(yīng)用丙氨酸定點(diǎn)突變技術(shù)，將Hsf4b分子中的高危磷酸化位點(diǎn)做突變掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsf4b DNA結(jié)合域的15位點(diǎn)絲氨酸突變對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用。本課題通過構(gòu)建Hsf4b DNA結(jié)合域15位點(diǎn)突變表達(dá)載體，構(gòu)建其在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并通過一系列實(shí)驗(yàn)，集中探討了S15位點(diǎn)磷酸化對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)理。 目的： 通過突變S15A位點(diǎn)研究磷酸化S15位點(diǎn)對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)理。 方法： 1.根據(jù)Genebank中小鼠的Hsf4b基因序列，按照設(shè)計(jì)引物的要求，使用primer premier5引物設(shè)計(jì)軟件及GPS2.1磷酸化位點(diǎn)檢測軟件，設(shè)計(jì)S15位點(diǎn)突變引物：（Primer S15上游引物： GAG CCA GGC CCC GCC CCC GTG CCT GCCPrimer S15下游引物：GGC AGG CAC GGG GGC GGG GCC TGG CTC）通過基因擴(kuò)增技術(shù)突變Hsf4b DNA結(jié)合域15位點(diǎn)，構(gòu)建突變體載體---pWZL-HA-Hsf4b-S15A，酶切及測序鑒定突變位點(diǎn)。 2.將表達(dá)野生Hsf4b和突變Hsf4b/S15A的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠晶狀體上皮細(xì)胞（mLEC/Hsf4-/-），用blasticidin篩選成功構(gòu)建穩(wěn)定株。 3.通過western-blotting驗(yàn)證該位點(diǎn)的突變影響了其下游蛋白的表達(dá)。 4.設(shè)計(jì)luciferase熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測Hsf4b和Hsf4b/S15A突變體對(duì)α B-晶體蛋白（alpha B-crystallin）基因啟動(dòng)子的調(diào)控。 結(jié)果： 1.通過基因擴(kuò)增技術(shù)將Hsf4b DNA結(jié)合域15位點(diǎn)突變，，構(gòu)建pWZL-HA-Hsf4b-S15A突變體載體。構(gòu)建其在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞（mLEC）中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。 2．與野生Hsf4b相比，Hsf4b-S15A突變可明顯抑制下游蛋白HSP25、alpha B-crystallin、alpha A-crystallin的表達(dá)。 3．15位點(diǎn)突變后的Hsf4b能抑制alpha B-crystallin基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論： Hsf4bS15位點(diǎn)的磷酸化對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控至關(guān)重要。丙氨酸突變S15A可明顯抑制Hsf4b對(duì)下游蛋白HSP25、alpha B-crystallin和alphaA-crystallin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。磷酸化S15位點(diǎn)參與調(diào)控Hsf4b與下游基因啟動(dòng)子的相互作用。
【關(guān)鍵詞】：Hsf4b 白內(nèi)障 晶狀體 磷酸化調(diào)控 丙氨酸定點(diǎn)突變
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R776.1;Q75
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文縮略詞表(ABBREVIATION)11-13
• 1 引言13-15
• 2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器15-23
• 2.1 主要試劑的配制15-20
• 2.2 菌株、載體和細(xì)胞株20-21
• 2.3 儀器設(shè)備21
• 2.4 主要試劑21-23
• 3 實(shí)驗(yàn)方法23-31
• 3.1 載體的構(gòu)建23-24
• 3.2 載體的鑒定24
• 3.3 質(zhì)粒的提取24-25
• 3.4 穩(wěn)定株的構(gòu)建25-26
• 3.5 細(xì)胞的收集、裂解和蛋白的提取26
• 3.6 BCA 試劑盒測定細(xì)胞總蛋白濃度26-27
• 3.7 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)水平27-29
• 3.8 Luciferase assay 熒光素酶試驗(yàn)29-31
• 4 結(jié)果31-37
• 4.1 載體質(zhì)粒的擴(kuò)增31
• 4.2 載體質(zhì)粒的酶切鑒定31-32
• 4.3 載體質(zhì)粒的測序鑒定32
• 4.4 穩(wěn)定株的構(gòu)建32-33
• 4.5 Western blotting 驗(yàn)證下游蛋白表達(dá)33
• 4.6 Western blotting 結(jié)果灰度分析33-34
• 4.7 Luciferase assay 結(jié)果34-37
• 5 討論37-41
• 結(jié)論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 文獻(xiàn)綜述45-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 致謝58-60
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)位論文目錄60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬增翼;張軍;李雪麗;席子明;胡延忠;;熱休克轉(zhuǎn)錄因子4b的克隆表達(dá)及MAP激酶P38對(duì)其磷酸化調(diào)控[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年04期

本文編號(hào)：1123517