本文關(guān)鍵詞：喉黏膜慢性炎癥組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為觀察

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【摘要】：聲帶外傷、感染等均可使聲帶固有層受到損害，影響發(fā)聲。如何預(yù)防和減少聲帶萎縮及聲帶在修復(fù)過程中疤痕的形成就成為了我們迫切需要改善并解決的一個(gè)重要問題。 人體組織內(nèi)成體干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡及分化是組織器官再生修復(fù)的生物學(xué)基礎(chǔ)。人喉黏膜固有層中也存在著具有良好的自我更新能力及多向誘導(dǎo)潛能的細(xì)胞，我們稱其為喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞（laryngeal mucosa mesenchymal stem cell，LM-MSCs）。我們?cè)O(shè)想將LM-MSCs植入受損聲帶，實(shí)現(xiàn)原位干細(xì)胞移植，來進(jìn)行聲帶損傷的修復(fù)，是否會(huì)為聲帶損傷的患者帶來新的希望呢？因此本實(shí)驗(yàn)組前期研究通過在聲帶損傷處植入熒光標(biāo)記的LM-MSCs，觀察其在聲帶內(nèi)的存活、轉(zhuǎn)歸以及對(duì)聲帶損傷的修復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM-MSCs在受損的聲帶固有層中存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8周以上，植入的細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間推移逐漸減少。有少數(shù)LM-MSCs在聲帶固有層內(nèi)轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，參與了聲帶的損傷修復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LM-MSCs可在一定程度上減輕聲帶的損傷。眾所周知，炎癥環(huán)境下機(jī)體自身難以完成疾病組織的自我再生修復(fù)，因而聲帶局部炎癥環(huán)境下，聲帶固有層細(xì)胞的存活能力、細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變是否影響著聲帶損傷的修復(fù)呢？因此本實(shí)驗(yàn)利用正常（下咽癌患者全喉切除手術(shù)，無病變一側(cè)的正常聲帶標(biāo)本）及炎癥（聲帶息肉手術(shù)的標(biāo)本）喉黏膜組織，觀察LM-MSCs在正常及局部炎癥組織中的表達(dá)和分布以及組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變。并檢測(cè)通過有限稀釋法獲取的正常及炎癥來源的LM-MSCs在體外的增殖活性、擴(kuò)增效應(yīng)、克隆形成能力、多向分化能力等，比較正常和炎癥組織來源LM-MSCs生物學(xué)特性，明確炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs生物學(xué)特性的影響。為進(jìn)一步揭示炎癥對(duì)LM-MSCs功能影響的分子機(jī)制及利用LM-MSCs解決聲帶組織缺損再生修復(fù)問題提供理論基礎(chǔ)。 研究目的： 分析比較正常及炎癥喉黏膜組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的差異，觀察LM-MSCs在正常及炎癥喉黏膜組織中的表達(dá)和分布，并通過對(duì)正常及炎癥來源的LM-MSCs（H-LM-MSCs和I-LM-MSCs）的鑒定及比較兩種LM-MSCs的增殖、分化能力，研究I-LM-MSCs的生物學(xué)特性，并探討炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs生物學(xué)行為的影響。 研究方法： 1.取正常及炎癥聲帶組織，組織塊石蠟包埋固定、切片。利用HE染色觀察正常及炎癥聲帶組織的大體結(jié)構(gòu)及炎癥浸潤(rùn)后組織結(jié)構(gòu)的變化。并且通過Masson trichrome染色及Elastin VG染色分別觀察組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維及彈力纖維的含量變化。 2.組織石蠟切片，通過免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)正常及慢性炎癥聲帶組織固有層中干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1的表達(dá)及分布。 3.利用組織消化、有限稀釋法獲取H-LM-MSCs和I-LM-MSCs，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的干細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)。 4.通過MTT、克隆形成率計(jì)算及流式細(xì)胞儀檢測(cè)H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的細(xì)胞周期及凋亡，同時(shí)比較兩種細(xì)胞的增殖能力。 5.將H-LM-MSCs和I-LM-MSCs分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)。通過茜素紅染色、Ca~(2+)定量、ALP染色比較不同來源LM-MSCs的成骨分化能力；通過油紅O染色，比較H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的成脂分化能力。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.正常聲帶組織HE染色可見聲帶組織由淺至深依次為復(fù)層鱗狀上皮、固有層、肌層，組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞外基質(zhì)排列有序，炎癥聲帶組織HE染色可見鱗狀上皮明顯增厚，固有層局部可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)胞外基質(zhì)成分染色結(jié)果顯示（通過切片IOD值檢測(cè)）：正常聲帶組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)排序整齊，Masson trichrome染色可見炎癥聲帶組織固有層膠原纖維增粗且排序紊亂，含量高于正常聲帶組織，Elastin VG染色可見彈力纖維變細(xì)，并且含量低于正常。 2.對(duì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示：正常及炎癥聲帶組織中均存在STRO-1的表達(dá)，，散在分布于組織固有層及肌層，并且兩組聲帶組織中STRO-1陽(yáng)性表達(dá)的數(shù)量無明顯差異。 3.在炎癥聲帶組織中同樣含有喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞，利用有限稀釋法得到的H-LM-MSCs和I-LM-MSCs外觀上都呈紡錘形的成纖維細(xì)胞樣，均具有一定的克隆形成能力，特異性干細(xì)胞表面分子標(biāo)記表達(dá)一致。 4.體外有限稀釋法單細(xì)胞培養(yǎng)的H-LM-MSCs和I-LM-MSCs均表現(xiàn)出自我更新能力；I-LM-MSCs組的克隆形成率高于正常組；MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果均顯示I-LM-MSCs的增值能力明顯高于對(duì)照組；細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示H-LM-MSCs和I-LM-MSCs凋亡率無明顯差異。 5.茜素紅染色及定量、ALP染色及ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，I-LM-MSCs成骨分化能力明顯低于H-LM-MSCs；油紅O染色結(jié)果顯示I-LM-MSCs成脂誘導(dǎo)后形成脂滴量明顯少于H-LM-MSCs，說明I-LM-MSCs的成脂分化能力降低。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)通過HE染色可見炎癥聲帶組織鱗狀上皮增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Massontrichrome染色結(jié)果顯示炎癥聲帶組織固有層膠原纖維增粗且排序紊亂，含量高于正常聲帶組織；Elastin VG染色結(jié)果顯示彈力纖維變細(xì)，并且含量低于正常。以上結(jié)果表明炎癥使聲帶組織上皮增生，固有層增厚，慢性炎癥致使聲帶組織的膠原含量增加，彈力纖維含量下降，最終導(dǎo)致聲帶組織瘢痕化加重、粘彈性降低。 2.免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示正常及炎癥聲帶組織固有層中散在干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1的表達(dá)，并且表達(dá)量無明顯差異，說明聲帶固有層中確實(shí)存在干細(xì)胞群體。 3.本實(shí)驗(yàn)從正常及炎癥聲帶組織中通過消化法、有限稀釋法成功獲得H-LM-MSCs和I-LM-MSCs，分離的細(xì)胞都具有一定的克隆形成能力，并且表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。說明兩種喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞均表現(xiàn)出干細(xì)胞的生物學(xué)特性。 4.正常及炎癥組織固有層間充質(zhì)干細(xì)胞均表現(xiàn)出自我更新的能力，但I(xiàn)-LM-MSCs的克隆形成率高于H-LM-MSCs，且MTT生長(zhǎng)曲線和流式細(xì)胞周期的結(jié)果均顯示I-LM-MSCs的增殖高于H-LM-MSCs。以上結(jié)果均說明慢性炎癥可促進(jìn)組織內(nèi)細(xì)胞增殖。 5.正常及炎癥組織固有層間充質(zhì)干細(xì)胞均有明顯的成骨、成脂分化潛能，I-LM-MSCs的成骨、成脂能力弱于H-LM-MSCs。說明炎癥微環(huán)境下LM-MSCs的分化能力降低。
【關(guān)鍵詞】：聲帶疤痕 喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞 炎癥微環(huán)境 增殖 成骨分化 成脂分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R767.4
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-22
• 一、聲帶損傷的治療18-19
• 二、喉黏膜干細(xì)胞與聲帶損傷修復(fù)19-20
• 三、炎癥微環(huán)境與干細(xì)胞20-22
• 實(shí)驗(yàn)一 正常及炎癥來源的聲帶組織固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的比較22-30
• 1 材料22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 4 討論29-30
• 實(shí)驗(yàn)二 STRO-1 在正常及炎癥聲帶組織中的表達(dá)及分布30-36
• 1 材料30-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-35
• 4 討論35-36
• 實(shí)驗(yàn)三 正常及炎癥來源的聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定36-45
• 1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-43
• 4 討論43-45
• 實(shí)驗(yàn)四 正常及炎癥來源的聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及凋亡能力的比較45-50
• 1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-47
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-49
• 4 討論49-50
• 實(shí)驗(yàn)五 正常及炎癥來源的聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的比較50-58
• 1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-56
• 4 討論56-58
• 小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果65-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 韓鵬;梁媛媛;趙昱;劉陽(yáng);楊潤(rùn)琴;鄧志宏;;犬聲帶激光損傷模型的建立及意義[J];聽力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志;2012年02期

2 劉陽(yáng);韓鵬;梁媛媛;鄧志宏;;不同部位喉黏膜間充質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年08期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 韓鵬;喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

2 劉陽(yáng);喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

本文編號(hào)：1119066