本文關鍵詞：MicroRNA調控上皮—間質轉化的機制及其對鼻咽癌細胞侵襲和遷移的影響

  更多相關文章： 鼻咽癌 耐藥 上皮-間質轉化 microRNA siRNA 侵襲 遷移

【摘要】：目的： 1.研究鼻咽癌耐藥細胞株的相關特性、上皮-間質轉化（EMT）相關表型，初步探討EMT與鼻咽癌耐藥、轉移的關系。 2.研究鼻咽癌耐藥細胞中microRNAs（miRNAs）的變化，并進一步篩選和驗證差異表達的miRNA。 3.探討miRNA調控EMT的機制及其對鼻咽癌細胞侵襲和遷移的影響。 方法： 1. MTT法探討不同濃度的順鉑(DDP)作用于鼻咽癌細胞HNE1，HNE1/DDP24、48、72h后對細胞存活率的影響，以明確其劑量-效應關系和耐藥指數(shù)；細胞生長情況采用不同時間（24、48、72、96、120、144、168h）計算鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP的細胞數(shù)目；利用Western blot檢測鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP中MRP、Mcl-1、Bcl-2、Bax、Puma的蛋白表達水平；利用熒光定量RT-PCR檢測鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP中MDR1、MRP、Bcl-2、Bax的mRNA變化。 2.采用細胞劃痕實驗檢測鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP的遷移能力；利用transwell小室作細胞遷移實驗與重組基底膜侵襲實驗檢測鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP在體外遷移與侵襲能力；倒置光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征；利用Western blot檢測鼻咽癌細胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相關蛋白E-cadherin、β-catenin、 Vimentin、Fibronectin、MMP-9及轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表達；利用熒光定量RT-PCR檢測鼻咽癌細胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相關標志E-cadherin、β-catenin、 Vimentin、Fibronectin、MMP-9及轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的mRNA變化。 3. MicroRNA（miRNA）芯片技術檢測鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP中miRNAs表達變化，并進一步篩選差異表達的miRNA；熒光定量RT-PCR驗證其差異表達的miRNA；利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP中HIF-1α的表達水平。 4.將miRNA的模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors）轉染進入鼻咽癌細胞中，熒光定量RT-PCR檢測miRNA的變化，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化，Transwell小室法檢測細胞的侵襲和遷移能力變化，利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測EMT相關標志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的變化，倒置光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征。 5.預測miRNA的潛在靶基因，利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測調控miRNA對靶基因的影響；轉染小干擾RNA，熒光定量RT-PCR檢測mRNA的變化，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化，Transwell小室法檢測細胞的侵襲和遷移能力變化，倒置光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征，Western blot和熒光定量RT-PCR檢測EMT相關標志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的變化。 結果： 1.鼻咽癌細胞HNE1/DDP對DDP具有耐藥的特性 (1) MTT法顯示：不同濃度的DDP (2、4、8、16、32μmol·L-1)在24、48、72h抑制鼻咽癌細胞HNE1、HNE1/DDP的增殖，且隨著DDP濃度的增加抑制作用增強。鼻咽癌細胞HNE1/DDP、HNE1在24、48、72h的半數(shù)抑制率(IC50)分別是29.04±2.82、19.44±1.77、11.39±1.89μmol·L-1和6.84±1.59、4.25±0.36、2.35±0.96μmol·L-1及其耐藥指數(shù)(RI)分別為4.25、4.57、4.85，HNE1/DDP細胞相對于HNE1細胞對DDP不敏感，且在正常培養(yǎng)條件下，HNE1/DDP細胞相對于HNE1細胞生長緩慢。 (2) Western blot結果顯示：HNE1/DDP細胞與HNE1細胞相比，MRP、Mcl-1、Bcl-2表達升高，但Bax、Puma表達下降。熒光定量RT-PCR結果顯示：在HNE1/DDP細胞中， MDR1、MRP、Bcl-2表達上調和Bax表達下調。 2. HNE1/DDP細胞增加侵襲和遷移的潛能，并誘發(fā)EMT (1)細胞劃痕實驗結果顯示，HNE1/DDP細胞與HNE1細胞相比具有較強的遷移能力。Transwell小室法結果顯示，HNE1/DDP細胞相對于HNE1細胞的體外遷移和侵襲能力明顯增強。 (2)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征，HNE1細胞是細胞與細胞連接、集落生長、圓形、沒有偽足形成，類似于上皮樣；相對而言，HNE1/DDP細胞是細胞與基質連接、狹長、分散性生長、有偽足形成，類似于間質樣。 (3) Western blot和熒光定量RT-PCR結果顯示，HNE1/DDP細胞中上皮標志分子（如E-cadherin、β-catenin）的表達明顯低于HNE1細胞，而HNE1/DDP細胞中間質標志分子（如Vimentin、Fibronectin、MMP-9）的表達明顯高于HNE1細胞。此外，，HNE1/DDP細胞中EMT相關轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表達明顯高于HNE1細胞。 3.鼻咽癌細胞中miRNA的表達 MiRNA芯片結果顯示，HNE1/DDP細胞與HNE1細胞相比有18種miRNAs表達上調和9種miRNAs表達下調。在這些miRNAs中，miR-10b是最具有差異表達的miRNA。在HNE1/DDP細胞與HNE1細胞相比中，熒光定量RT-PCR驗證miR-10b具有25倍上調。同時，Western blot和熒光定量RT-PCR結果顯示，HNE1/DDP細胞中HIF-1α的表達明顯高于HNE1細胞。 4. MiR-10b調控EMT及其對鼻咽癌細胞侵襲和遷移的影響 (1)表達miR-10b的HNE1細胞轉染miR-10b的模擬物，高表達miR-10b的HNE1/DDP細胞轉染miR-10b抑制劑。熒光定量RT-PCR結果顯示，miR-10b模擬物能升高miR-10b的表達，而miR-10b抑制劑能抑制miR-10b的表達。 (2)劃痕實驗結果顯示，miR-10b模擬物能明顯增強HNE1細胞遷移能力，miR-10b抑制劑降低HNE1/DDP細胞遷移能力。此外，Transwell小室法結果顯示，miR-10b模擬物能明顯增加HNE1細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)，miR-10b抑制劑減少HNE1/DDP細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)。 (3) Western blot和熒光定量RT-PCR結果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細胞中E-cadherin減少和Vimentin、MMP-9增加，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9減少。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征，miR-10b模擬物能使HNE1細胞中出現(xiàn)更多的間質樣細胞，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細胞從間質樣梭形細胞轉化為上皮樣細胞。 5. MiR-10b通過介導KLF4和Notch1對鼻咽癌細胞EMT的調控作用 (1)采用miRTarBase軟件預測miR-10b的靶基因，其中KLF4和Notch1選作進一步研究。Western blot和熒光定量RT-PCR結果顯示，HNE1/DDP細胞中KLF4的表達明顯低于HNE1細胞，但Notch1的表達高于HNE1細胞。 (2) Western blot結果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細胞中KLF4減少，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細胞中KLF4增加。但熒光定量RT-PCR結果顯示，miR-10b的過表達或抑制對KLF4沒有影響。Western blot和熒光定量RT-PCR結果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細胞中Notch1增加，而miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細胞中Notch1減少。 (3)將鼻咽癌細胞HNE1/DDP轉染Notch1siRNA和對照siRNA，培養(yǎng)48h后，western blot和qRT-PCR檢測Notch1表達減少。劃痕實驗結果顯示，Notch1siRNA能明顯減少HNE1/DDP細胞的遷移能力。此外，Transwell小室法結果顯示，Notch1siRNA能明顯減少HNE1/DDP細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)。 (4)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征，Notch1siRNA能使HNE1/DDP細胞從間質樣梭形細胞轉化為上皮樣細胞。Western blot和熒光定量RT-PCR結果顯示，Notch1siRNA能使HNE1/DDP細胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9減少。 結論： 1.順鉑耐藥鼻咽癌細胞具有耐藥的特性，進而誘發(fā)EMT變化且增加侵襲和遷移的潛能。 2.多個miRNA在鼻咽癌細胞中差異表達，可能在順鉑耐藥和EMT中起重要作用。 3.過表達的miR-10b能促進HNE1細胞的侵襲和遷移，并且伴隨著EMT的發(fā)生。相反，抑制miR-10b的表達能夠逆轉EMT。此外，miR-10b在轉錄后調控KLF4的表達，其在鼻咽癌細胞中可能通過KLF4調控EMT。 4. Notch1與miR-10b的變化水平相一致；Notch1基因敲除降低HNE1/DDP細胞的遷移和侵襲，并逆轉EMT。在鼻咽癌細胞中，調控miR-10b減少Notch1的表達能夠逆轉EMT。
【關鍵詞】：鼻咽癌 耐藥 上皮-間質轉化 microRNA siRNA 侵襲 遷移
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-17
• 材料與方法17-32
• 1. 材料與儀器17-18
• 2. 實驗方法18-31
• 3. 統(tǒng)計學處理31-32
• 結果32-49
• 1. 鼻咽癌細胞 HNE1/DDP 對 DDP 具有耐藥的特性32-34
• 2. 鼻咽癌 HNE1/DDP 細胞增加侵襲和遷移的潛能,并誘發(fā) EMT34-37
• 3. 鼻咽癌細胞中 miRNA 的表達37-39
• 4. MiR-10b 調控 EMT 及其對鼻咽癌細胞侵襲和遷移的影響39-44
• 5. MiR-10b 通過介導 KLF4 和 Notch1 對鼻咽癌細胞 EMT 的調控作用44-49
• 討論49-53
• 結論53-54
• 參考文獻54-57
• 致謝57-58
• 附錄A 英中文術語縮略語表58-59
• 附錄B 常用試劑配制方法59-62
• 附錄C 個人簡歷及發(fā)表論文62-63
• 附錄D 綜述63-72
• 參考文獻69-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Samantha F.Kornfeld;Kyle K.Biggar;Kenneth B.Storey;;Differential Expression of Mature MicroRNAs Involved in Muscle Maintenance of Hibernating Little Brown Bats, Myotis lucifugus: A Model of Muscle Atrophy Resistance[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2012年05期

2 Xiang-Ming Ding;;MicroRNAs: regulators of cancer metastasis and epithelialmesenchymal transition(EMT)[J];Chinese Journal of Cancer;2014年03期

本文編號：1115507