本文關(guān)鍵詞：順鉑在喉癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中的機(jī)制研究

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【摘要】：喉癌是喉部最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率目前有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì),占全身惡性腫瘤的5.7%一7.6%[1],發(fā)病機(jī)理目前仍存在許多假說(shuō),一般認(rèn)為與吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染和性激素及受體有關(guān)。雖然近年隨著微創(chuàng)手術(shù)、放療、化療、同步放化療及生物治療等綜合性治療措施改進(jìn)以及共同應(yīng)用,已使患者的生存時(shí)間及生活質(zhì)量有所提高，但喉癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及對(duì)放化療不敏感常使治療效果欠佳。越來(lái)越多的研究表明，這可能與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。 腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells,CSCs）學(xué)說(shuō)認(rèn)為:腫瘤組織中存在極少量充當(dāng)干細(xì)胞角色的腫瘤細(xì)胞,它們具有自我更新和多向分化潛能,在腫瘤的形成和生長(zhǎng)中起著重要作用,是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。側(cè)群細(xì)胞（sidepopulation，SP）分析法作為腫瘤干細(xì)胞分離鑒定的一種方法，主要是利用干細(xì)胞能夠?qū)晒馊玖螲 oechst33342外排的特性,經(jīng)過(guò)紫外激發(fā)后用雙波長(zhǎng)(450nm和675nm以上波長(zhǎng))監(jiān)測(cè),可以觀察到這群細(xì)胞發(fā)出微弱的藍(lán)色和紅色熒光,在流式二維分析點(diǎn)陣圖上,呈彗星狀分布在陽(yáng)性染色的主群(main population,MP或者non-SP)細(xì)胞的一側(cè)[1,2]。 第一部分喉癌側(cè)群細(xì)胞分選的條件優(yōu)化 【目的】探討喉癌細(xì)胞株Hep-2中側(cè)群細(xì)胞（side population，SP）分選的優(yōu)化條件。 【方法】取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞，予胰酶消化后，用含2%胎牛血清1640培養(yǎng)基制成1×106個(gè)/ml單細(xì)胞懸液。①實(shí)驗(yàn)組喉癌細(xì)胞懸液中加入Hoechst33342至終濃度分別為5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml，于37℃中孵育90min。②取單細(xì)胞懸液，分別于37°水浴中孵育Hoechst50、70、90、110、130min。③實(shí)驗(yàn)組喉癌細(xì)胞懸液加入Hoechst后，分別孵育于37°水浴及37°恒溫箱中。兩組保持Hoechst濃度及細(xì)胞密度一致。④取匯合度分別為100%、70%的兩瓶細(xì)胞，同上制成單細(xì)胞懸液。分別加入相同濃度的Hoechst，并于37°水浴。染色結(jié)束于冰上終止染色5min后，離心，去上清，加入PBS重懸細(xì)胞，且均于上機(jī)前5min加入碘化丙啶（PI）至1μg/ml，后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)鑒定。以上各組均設(shè)陰性組于Hoechst染色前加維拉帕米，至終濃度為150μmol/ml，，并于37℃中孵育30min后，其他各條件保持與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組一致。 【結(jié)果】①當(dāng)Hoechst33342濃度分別為5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml時(shí)，SP%分別為（39.96±0.240）%、（26.23±0.385）%、（18.79±0.023）%、（19.01±0.138）%，死細(xì)胞比例分別為（30.45±0.634)%、(49.9±0.42)%、(50.12±0.68)%、(64.16±0.387)%。②Hoechst在37°水浴中孵育90min時(shí)，流式細(xì)胞圖形最典型，SP%為(17.37±1.423）%；③孵育于37°水浴較孵育恒溫箱中，實(shí)驗(yàn)組未被Hoechst33342標(biāo)記的細(xì)胞分別為（18.67±0.448）%、（22.6±0.497）%；④匯合度90%以上較匯合度70%的細(xì)胞，SP%由（19.075±0.464)%降到（16.073±0.519)%。以上結(jié)果均經(jīng)SPSS16.0分析，p0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)論】在流式細(xì)胞儀分選喉癌Hep-2側(cè)群細(xì)胞中Hoechst33342的最佳濃度為10μg/ml，最佳孵育時(shí)間為90min，且水浴優(yōu)于恒溫箱中孵育，細(xì)胞密度最好選擇80-90%之間。 第二部分喉癌側(cè)群細(xì)胞的分選及其體外生物學(xué)特性 【目的】探討喉癌細(xì)胞株Hep-2中干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞（side population,SP）的分選方法及側(cè)群細(xì)胞的干細(xì)胞特性。 【方法】制備喉癌Hep-2單細(xì)胞懸液，經(jīng)Hoechst33342染色后，用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分選出人喉癌側(cè)群和非側(cè)群(non-SP,NSP)細(xì)胞，測(cè)定SP細(xì)胞亞群所占的比例。電子顯微鏡下觀察SP及NSP細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)兩群細(xì)胞的細(xì)胞周期、CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)SP及NSP細(xì)胞中的ABCG2mRNA的相對(duì)量，結(jié)果用2-Δ(ΔCt)計(jì)算。 【結(jié)果】流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，SP細(xì)胞在Hep-2細(xì)胞株中占(13.17±1.85)％.生長(zhǎng)曲線（CCK8法）示，SP細(xì)胞較NSP細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力；兩者所處的細(xì)胞周期相似，S期細(xì)胞比例及增殖指數(shù)(proliferation index，PI）兩者相比，t分別為0．678、0．614(p0.05)。RT-PCR示SP中ABCG2mRNA含量高于NSP。 【結(jié)論】人Hep-2細(xì)胞株中存在一部分能將Hoechst33342排出的側(cè)群細(xì)胞。SP細(xì)胞較NSP有更強(qiáng)的體外增殖能力，具有干細(xì)胞活性。SP細(xì)胞中ABCG2mRNA表達(dá)量明顯高于NSP細(xì)胞。 第三部分順鉑在喉癌非側(cè)群細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中作用的探討 【目的】探討喉癌細(xì)胞株Hep2經(jīng)流式分選后的非側(cè)群細(xì)胞經(jīng)化療藥物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)制。 【方法】喉癌Hep2細(xì)胞株經(jīng)流式細(xì)胞儀熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)（fluorescence-actived cell sortin,FACS）分選后，獲得的非側(cè)群待貼壁80%后分別加入順鉑（實(shí)驗(yàn)組）和生理鹽水(對(duì)照組)培養(yǎng)48h，再次上流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組側(cè)群細(xì)胞比例;并通過(guò)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及western blot分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)兩組細(xì)胞的干細(xì)胞樣標(biāo)記β-catenin、notch-1的基因和蛋白的表達(dá)情況。 【結(jié)果】實(shí)驗(yàn)組非側(cè)群細(xì)胞經(jīng)順鉑（終濃度1ug/ml）作用48h后，側(cè)群細(xì)胞比例為(17.16±0.18)%，對(duì)照組則為(10.05±1.20)%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.844，P=0.004）。熒光定量RT-PCR示經(jīng)順鉑處理實(shí)驗(yàn)組的β-catenin、notch-1mRNA較對(duì)照組顯著增多；western blot示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中β-catenin、notch-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(t=5.155，P=0.031；t=5.977，P=0.004）。 【結(jié)論】非側(cè)群細(xì)胞經(jīng)化療藥物順鉑誘導(dǎo)后可分化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞。其可能機(jī)制是通過(guò)wnt/β-catenin、notch轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常誘導(dǎo)非側(cè)群細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：喉癌 側(cè)群細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù) 順鉑 β-catenin notch-1
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65
【目錄】：

• 目錄3-4
• 英文縮寫(xiě)4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 喉癌細(xì)胞株 Hep-2 中側(cè)群細(xì)胞分選條件優(yōu)化材料方法16-30
• 材料方法16-20
• 結(jié)果20-25
• 討論25-26
• 參考文獻(xiàn)26-30
• 第二部分 喉癌中側(cè)群細(xì)胞的分選及其體外生物學(xué)特性材料方法30-43
• 材料方法30-34
• 結(jié)果34-39
• 討論39-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 第三部分 順鉑在喉癌非側(cè)群細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中作用的探討材料方法43-57
• 材料方法43-47
• 結(jié)果47-49
• 討論49-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 綜述 側(cè)群細(xì)胞與喉癌腫瘤干細(xì)胞57-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 發(fā)表論文67
• 碩士在讀期間參加的學(xué)術(shù)會(huì)議67
• 碩士在讀期間參與研究的課題67-68
• 致謝68-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉巖;喉癌側(cè)群細(xì)胞生物學(xué)特性的研究[D];吉林大學(xué);2011年

本文編號(hào)：1095708